Este protocolo fornece um método para produzir várias centenas de esferoides tumorais multicelulares em cada poço de uma placa multi-poço adequada para microscopia automatizada. Os spheroid produzidos podem ser categorizados em diferentes classes de tamanho, e informações subcelulares podem ser extraídas de cada célula. A técnica produz soros suficientes que podem ser usados em estudos de triagem direta e interferência de RNA.
Diluir material do porão ECM em meio livre de soro vermelho fenol frio usando pontas pré-refrigeradas mantidas a menos 20 graus Celsius. Aposto 15 microliters do material do porão ECM e solução média em uma placa de imagem de 96 poços. Centrifugar a placa por 20 minutos a 91 vezes G a quatro graus Celsius.
Incubar a placa por não mais do que 30 minutos a 37 graus Celsius. Adicione viagens e EDTA às células. Incubar as células a 37 graus Celsius no final da incubação, suspendemos as células em um meio completo contendo 10% de FBS.
Pipeta 10 microliters da suspensão celular, em uma câmara de contagem de hemótmetros. Conte o número de células em quatro quadrantes da câmara. Centra vê as células a 135 vezes G por quatro minutos em temperatura ambiente.
Uma dessas células são pelotas, aspiram o supernascido e resuspensam as células em um meio completo livre de fenol para obter uma concentração de 10 às seis células por mililitro. Diluir as células em um meio completo livre de fenol. Veja as células em movimento circular em um volume total de 35 microliters por poço.
Incubar as células por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. A 1,2 microliters de material de porão ECM para 23,8 microliters de fenóis vermelho livre meio completo por poço, resultando em um volume final de 60 microliters por poço. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, substitua o meio por 100 microliters de fenol vermelho livre de meio. Insira a placa de 96 poços contendo esferoides, em um microscópio de triagem de alto teor confocal. Selecione os lasers apropriados para excitar os pisos utilizados.
Adquira os canais sequencialmente para evitar crosstalk, imagem dos esferoides usando objetivos apropriados. Para analisar a morfologia dos esferoides, segmente os esferoides com base no FLoid fluorescentemente conjugado e coloração. Segmente os núcleos com base no hexe, três, três, quatro, duas manchas.
Segmente o citoplasma de cada célula pelo hexeto residual três, três, quatro, dois, mancha que está presente no citoplasma celular. Calcule diferentes propriedades morfológicas dos esferoides, incluindo volume, área de superfície, esferonicalidade e o número de núcleos por seus esferoides. Ross tem imagens mais para remover esferoides menores que 75 micrômetros cúbicos e um maior que 900.000 micrômetros cúbicos.
Para analisar uma única célula dentro de esferoides, segmente os esferoides com base na coloração esferoide conjugada fluorescente. Segmente os núcleos com base no hexe, três, três, quatro, duas manchas. Segmente o citoplasma de cada célula pelo hexeto residual três, três, três, quatro, duas manchas que estão presentes no citoplasma celular.
Segmente os lysosomos com base na coloração de anticorpos secundários. Calcular diferentes propriedades morfológicas das células dentro de cada esferoide, incluindo o número de lysosos por célula, volume celular e área de superfície celular. A figura mostra bem visões gerais de três tipos diferentes de esferoides, incluindo imagens em diferentes planos confocal.
Uma visão volumosa de todos os esferoides também é mostrada. A figura mostra o processo de segmentação do pH, o painel A mostra todos os esferoides em uma visão volumosa. O painel B exibe a segmentação do conjunto do citoplasma, dos núcleos e dos liseosmos dentro de todas as células de um único esferoides.
O citoplasma e os núcleos são segmentados com base no hexe, três, três, quatro, duas manchas. E os lysosomos são segmentados com base no anti-laboratório uma mancha de anticorpos. Os painéis C mostram o mesmo segmentado do painel B, mas em uma vista de três planícies.
Várias medidas morfológicas no nível dos esferoides podem ser feitas. Essas medidas incluem o cálculo do número de núcleos per esferoides, bem como estas felicity, volume e superfície do pH. O volume típico de cada célula nos três tipos de esferoides.
Assim como o número de lysososomes por célula são mostrados neste número. Otimizar a densidade inicial de assentos celulares no início da geração de SP é um passo crítico. A figura mostra que adicionar muitas células ainda permite a formação de esferoides.
No entanto, isso pode resultar na fusão se spheroids. Os spheróides produzidos dessa forma podem ser submetidos à análise transcriômica e proteômica. Esta técnica é usada para analisar quantitativamente a absorção de medicamentos que entregam tais nanopartículas e avaliar sua toxicidade para células individuais nos esferoides.
