Este protocolo desenvolveu um método para estimar o rendimento de compostos na placa TLC usando a técnica de iluminação azul-LED. As vantagens deste método são que a técnica de iluminação azul-LED é um método seguro, eficaz e barato, e permite ao pesquisador medir várias amostras ao mesmo tempo. Este método também pode ser aplicado à bioquímica e química de produtos naturais.
Para começar, seque a cultura a 40 graus Celsius por 24 horas. Transfira a cultura seca para um tubo de 50 mililitros usando pinças esterilizadas e adicione 15 mililitros de acetato de etila. Agitar a mistura vigorosamente por vórtice durante um minuto e incubar o tubo durante uma hora a 40 graus Celsius com agitação a 200 RPM.
Em seguida, sonicate a mistura usando um banho ultra-sônico de 40 kilohertz a 40 graus Celsius por uma hora. Em seguida, centrifugar a mistura a 5.000 G por um minuto à temperatura ambiente e filtrar através de um papel de filtro de 11 micrômetros. Extrair o filtrado com um volume igual de água estéril numa ampola separatória.
Após a separação de fases, colete a camada orgânica, evapore-a em um evaporador rotativo e dissolva o resíduo em dois mililitros de acetato de etila. Embale a coluna com sílica gel de fase normal como fase estacionária e use acetato de etila n-hexano e ácido trifluoroacético como fase móvel. Carregue dois mililitros do extracto na coluna e adicione o solvente de fase móvel a um caudal de um mililitro por minuto para eluír o extracto.
Depois de verificar o efluente por TLC para confirmar a presença de lovastatina, evaporar em um evaporador rotativo a 45 graus Celsius até que o solvente seja removido. Dissolva o resíduo em um mililitro de acetato de etila e, em seguida, misture com um volume igual de 1% de ácido trifluoroacético. Centrifugar a mistura a 5.000 G por um minuto à temperatura ambiente e coletar a camada orgânica em um novo tubo de vidro.
Usando uma pipeta capilar spot cinco microlitros de amostras e padrões de lovastatina na linha de base da placa TLC, deixando uma borda de um centímetro nas laterais da placa TLC. Em seguida, seque a placa TLC em um exaustor por cinco minutos à temperatura ambiente. Coloque a placa suavemente por pinça em uma câmara de vidro saturada contendo o solvente de fase móvel.
Cubra a câmara com uma tampa de vidro e deixe a placa se desenvolver completamente. Remova a placa da câmara quando a linha de solventes atingir um centímetro do topo da placa. Marque a linha de solvente com um lápis e seque a placa no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
Após a secagem, mergulhe imediatamente a placa em solvente de ácido sulfúrico a 10% e, em seguida, seque no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a placa no painel de aquecimento até que as manchas marrons apareçam. Transfira a placa para o iluminador LED azul e digitalize usando freeware compatível.
Os resultados obtidos a partir do método de bioensaio demonstraram que o quadrado R entre as dimensões da zona de inibição e os padrões de lovastatina foi de 0,99, e o rendimento da amostra foi de 0,56 miligramas, conforme previsto pelo modelo de regressão. O método de detecção de UV mostra que o quadrado R entre os padrões de lovastatina e a dimensão das bandas na placa TLC foi de 0,97, e o rendimento amostral previsto pelo modelo de regressão foi de 0,53 miligramas. No entanto, as bordas da banda estavam borradas e bandas de intensidade de sinal relativamente baixas foram observadas.
Para o método de iluminação azul-LED, o quadrado R entre os padrões de lovastatina e a dimensão da banda na placa TLC foi de 0,98, e o rendimento da amostra foi de 0,54 miligramas, conforme previsto pelo modelo de regressão. O rendimento previsto utilizando o iluminador LED-azul foi mais próximo do método de bioensaio e bandas claras foram obtidas. Se a placa estiver superaquecida, a visualização da lovastatina pode ser difícil de observar.
