הערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED

פרוטוקול זה פיתח שיטה להערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED. היתרונות של שיטה זו הם שטכניקת התאורה blue-LED היא שיטה בטוחה, יעילה וזולה, ומאפשרת לחוקר למדוד מספר דגימות בו זמנית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על ביוכימיה וכימיה של מוצרים טבעיים.

כדי להתחיל, לייבש את התרבות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מעבירים את התרבית המיובשת לצינור של 50 מיליליטר באמצעות פינצטה מעוקרת ומוסיפים 15 מיליליטר של אתיל אצטט. מנערים את התערובת במרץ על ידי מערבולת במשך דקה אחת ודוגרים את הצינור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.

לאחר מכן sonicate את התערובת באמצעות 40 קילוהרץ אמבטיה קולית ב 40 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, צנטריפוגה תערובת ב 5, 000 גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לסנן דרך נייר סינון 11 מיקרומטר. מוציאים את התסנין בנפח שווה של מים סטריליים במשפך מפריד.

לאחר הפרדת פאזה, לאסוף את השכבה האורגנית, להתאדות אותו במאייד סיבובי, ולהמיס את השאריות בשני מיליליטר של אתיל אצטט. ארזו את העמודה עם ג'ל סיליקה פאזה רגילה כפאזה נייחת, והשתמשו ב-n-הקסאן אתיל אצטט וחומצה טריפלואורואצטית כפאזה הניידת. העמיסו שני מיליליטר של התמצית על העמודה והוסיפו את ממס הפאזה הנייד בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה כדי להחליק את התמצית.

לאחר אימות הקולחים על ידי TLC כדי לאשר את נוכחותו של lovastatin, להתאדות במאייד סיבובי ב 45 מעלות צלזיוס עד שהממס מוסר. ממיסים את השאריות במיליליטר אחד של אתיל אצטט ואז מערבבים עם נפח שווה של 1% חומצה טריפלואורואצטית. צנטריפוגה תערובת ב 5, 000 גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאסוף את השכבה האורגנית בצינור זכוכית חדש.

באמצעות פיפטה נימית מזהים חמישה מיקרוליטרים של דגימות ותקני לובסטטין על קו הבסיס של צלחת TLC, ומשאירים גבול של סנטימטר אחד בצידי לוח TLC. לאחר מכן יבשו את צלחת ה-TLC במכסה אדים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את הצלחת בעדינות על ידי מלקחיים בתא זכוכית רוויה המכיל את ממס הפאזה הנייד.

מכסים את התא במכסה זכוכית ומאפשרים לצלחת להתפתח במלואה. הסר את הצלחת מהתא כאשר קו הממסים מגיע לסנטימטר אחד מראש הצלחת. מסמנים בעיפרון את קו הממס ומייבשים את הצלחת במכסה האדים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הייבוש, יש להשרות מיד את הצלחת בממס 10% חומצה גופרתית, ולאחר מכן לייבש במכסה האדים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הצלחת על לוח החימום עד להופעת הכתמים החומים. העבר את הצלחת לתאורת ה-LED הכחולה וסרוק באמצעות תוכנה חופשית תואמת.

התוצאות שהתקבלו משיטת הביו-אסאי הראו כי ריבוע R בין ממדי אזור העיכוב לתקני לובסטטין היה 0.99, ותפוקת המדגם הייתה 0.56 מיליגרם כפי שנחזה על ידי מודל הרגרסיה. שיטת זיהוי UV מראה כי ריבוע R בין תקני lovastatin לבין ממד הפסים על לוח TLC היה 0.97, ותפוקת הדגימה שנחזתה על ידי מודל הרגרסיה הייתה 0.53 מיליגרם. עם זאת, קצוות הלהקה היו מטושטשים ונצפו פסים בעוצמת אות נמוכה יחסית.

עבור שיטת התאורה הכחולה-LED, ריבוע R בין תקני לובסטטין לבין ממד הפס בלוח TLC היה 0.98, ותפוקת הדגימה הייתה 0.54 מיליגרם כפי שנחזה על ידי מודל הרגרסיה. התפוקה החזויה באמצעות תאורת ה-LED הכחולה הייתה קרובה יותר לשיטת הביו-אסאי והתקבלו פסים ברורים. אם הצלחת מחוממת יתר על המידה, ההדמיה של lovastatin עשוי להיות קשה לצפייה.