このプロトコルは、青色LED照明技術を使用してTLCプレート上の化合物の収率を推定する方法を開発しました。この方法の利点は、青色LED照明技術が安全で効果的で安価な方法であり、研究者が複数のサンプルを同時に測定できることです。この方法は、生化学や天然物化学にも適用できます。
はじめに、培養液を摂氏40度で24時間乾燥させます。滅菌ピンセットを使用して乾燥した培養物を50ミリリットルのチューブに移し、15ミリリットルの酢酸エチルを加える。混合物を1分間ボルテックスして激しく振盪し、200RPMで振とうしながら摂氏40度で1時間チューブをインキュベートします。
次に、40キロヘルツの超音波浴を使用して40°Cで1時間混合物を超音波処理します。次に、混合物を室温で1分間5, 000 Gで遠心分離し、11マイクロメートルのろ紙でろ過します。分液漏斗で等量の滅菌水でろ液を抽出する。
相分離後、有機層を収集し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、残留物を2ミリリットルの酢酸エチルに溶解します。固定相として順相シリカゲルをカラムに充填し、移動相としてn-ヘキサン酢酸エチルとトリフルオロ酢酸を使用します。2ミリリットルの抽出液をカラムにロードし、移動相溶媒を毎分1ミリリットルの流速で添加して抽出物を溶出します。
TLCで廃液を検証してロバスタチンの存在を確認した後、溶媒が除去されるまで摂氏45度のロータリーエバポレーターで蒸発させます。残留物を1ミリリットルの酢酸エチルに溶解し、次に等量の1%トリフルオロ酢酸と混合する。混合物を室温で1分間5, 000 Gで遠心分離し、有機層を新しいガラス管に集めます。
キャピラリーピペットを使用して、5マイクロリットルのサンプルとロバスタチン標準物質をTLCプレートのベースラインにスポットし、TLCプレートの側面に1センチメートルの境界を残します。次に、TLCプレートをヒュームフードで室温で5分間乾燥させます。プレートを鉗子で移動相溶媒の入った飽和ガラスチャンバーにそっと置きます。
チャンバーをガラス蓋で覆い、プレートが完全に発達するようにします。溶媒ラインがプレートの上部から1センチメートルに達したら、チャンバーからプレートを取り外します。溶剤線を鉛筆でマークし、ドラフト内でプレートを室温で10分間乾燥させます。
乾燥後、すぐにプレートを10%硫酸溶媒に浸し、ヒュームフード内で室温で10分間乾燥させます。次に、茶色の斑点が現れるまでプレートを加熱パネルに置きます。プレートを青色LEDイルミネーターに移し、互換性のあるフリーウェアを使用してスキャンします。
バイオアッセイ法から得られた結果は、阻害ゾーンとロバスタチン標準物質の寸法との間のR二乗が0.99であり、回帰モデルによって予測されるようにサンプル収量が0.56ミリグラムであることを示した。UV検出法は、ロバスタチン標準とTLCプレート上のバンドの寸法との間のR二乗が0.97であり、回帰モデルによって予測されたサンプル収量が0.53ミリグラムであったことを示している。ただし、バンドのエッジはぼやけており、比較的低い信号強度のバンドが観察されました。
青色LED照明法の場合、ロバスタチン標準とTLCプレート上のバンドの寸法との間のR二乗は0.98であり、サンプル収量は回帰モデルによって予測されるように0.54ミリグラムであった。青色LED照明器を用いた予測収率はバイオアッセイ法に近く、明瞭なバンドが得られた。プレートが過熱すると、ロバスタチンの可視化を観察することが困難になる可能性があります。
