Этот протокол разработал метод оценки выхода соединений на пластине TLC с использованием метода синего светодиодного освещения. Преимущества этого метода заключаются в том, что техника сине-светодиодного освещения является безопасным, эффективным и дешевым методом и позволяет исследователю измерять несколько образцов одновременно. Этот метод также может быть применен к биохимии и химии натуральных продуктов.
Для начала высушите культуру при 40 градусах Цельсия в течение 24 часов. Переложите высушенную культуру в 50-миллилитровую трубку с помощью стерилизованного пинцета и добавьте 15 миллилитров этилацетата. Энергично встряхните смесь вихрем в течение одной минуты и высиживайте трубку в течение одного часа при 40 градусах Цельсия с встряхиванием при 200 оборотах в минуту.
Затем обработайте смесь ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны мощностью 40 килогерц при температуре 40 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем центрифугируют смесь при 5 000 г в течение одной минуты при комнатной температуре и фильтруют через 11-микрометровую фильтровальную бумагу. Экстрагировать фильтрат равным объемом стерильной воды в сепараторную воронку.
После разделения фаз собирают органический слой, испаряют его во вращающемся испарителе и растворяют остаток в двух миллилитрах этилацетата. Упакуйте колонку силикагелем нормальной фазы в качестве стационарной фазы и используйте н-гексан этилацетат и трифторуксусную кислоту в качестве подвижной фазы. Загрузите два миллилитра экстракта на колонну и добавьте растворитель подвижной фазы со скоростью потока один миллилитр в минуту для элюляции экстракта.
После проверки сточных вод TLC для подтверждения присутствия ловастатина выпаривают во вращающемся испарителе при 45 градусах Цельсия до тех пор, пока растворитель не будет удален. Растворяют остаток в одном миллилитре этилацетата и затем смешивают с равным объемом 1% трифторуксусной кислоты. Центрифугируйте смесь при 5000 г в течение одной минуты при комнатной температуре и соберите органический слой в новую стеклянную трубку.
Используя капиллярную пипетку, нанесите пять микролитров образцов и эталонов ловастатина на базовую линию пластины TLC, оставив границу в один сантиметр по бокам пластины TLC. Затем высушите пластину TLC в вытяжке в течение пяти минут при комнатной температуре. Аккуратно поместите пластину щипцами в насыщенную стеклянную камеру, содержащую растворитель подвижной фазы.
Накройте камеру стеклянной крышкой и дайте пластине полностью развиться. Извлеките пластину из камеры, когда линия растворителей достигнет одного сантиметра от верхней части пластины. Пометьте карандашом линию растворителя и высушите пластину в вытяжке в течение 10 минут при комнатной температуре.
После высыхания сразу же замочите пластину в 10%-ном растворителе серной кислоты, а затем высушите в вытяжке в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем поместите пластину на нагревательную панель до появления коричневых пятен. Перенесите пластину на сине-светодиодный осветитель и просканируйте с помощью совместимых бесплатных программ.
Результаты, полученные методом биоанализа, показали, что квадрат R между размерами зоны ингибирования и стандартами ловастатина составлял 0,99, а выход образца составлял 0,56 миллиграмма, как и предсказывалось регрессионной моделью. Метод обнаружения УФ показывает, что квадрат R между стандартами ловастатина и размером полос на пластине TLC составлял 0,97, а выход образца, предсказанный регрессионной моделью, составлял 0,53 миллиграмма. Тем не менее, края полосы были размытыми, и наблюдались относительно низкие полосы интенсивности сигнала.
Для метода сине-светодиодного освещения квадрат R между стандартами ловастатина и размером полосы на пластине TLC составлял 0,98, а выход образца составлял 0,54 миллиграмма, как и предсказывалось регрессионной моделью. Прогнозируемый выход с использованием синего светодиодного осветителя был ближе к методу биоанализа и были получены четкие полосы. Если пластина перегревается, визуализацию ловастатина может быть трудно наблюдать.
