Bu protokol, mavi-LED aydınlatma tekniğini kullanarak TLC plakasındaki bileşiklerin verimini tahmin etmek için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemin avantajları, mavi-LED aydınlatma tekniğinin güvenli, etkili ve ucuz bir yöntem olması ve araştırmacının aynı anda birden fazla numuneyi ölçmesine izin vermesidir. Bu yöntem biyokimya ve doğal ürünler kimyasına da uygulanabilir.
Başlamak için, kültürü 24 saat boyunca 40 santigrat derecede kurutun. Kurutulmuş kültürü sterilize cımbız kullanarak 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 15 mililitre etil asetat ekleyin. Karışımı bir dakika boyunca vorteksleme yaparak kuvvetlice çalkalayın ve tüpü 200 RPM'de çalkalayarak 40 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra bir saat boyunca 40 santigrat derecede 40 kilohertz ultrasonik banyo kullanarak karışımı sonikleştirin. Daha sonra, karışımı oda sıcaklığında bir dakika boyunca 5.000 G'de santrifüj edin ve 11 mikrometrelik bir filtre kağıdından süzün. Filtrasyonu bir ayırma hunisinde eşit miktarda steril su ile çıkarın.
Faz ayırmadan sonra, organik tabakayı toplayın, döner bir evaporatörde buharlaştırın ve kalıntıyı iki mililitre etil asetat içinde çözün. Kolonu sabit faz olarak normal faz silika jeli ile paketleyin ve mobil faz olarak n-hekzan etil asetat ve trifloroasetik asit kullanın. Ekstraktın iki mililitresini kolona yükleyin ve ekstraktı ertelemek için mobil faz çözücüyü dakikada bir mililitre akış hızında ekleyin.
Lovastatinin varlığını doğrulamak için atık suyu TLC ile doğruladıktan sonra, çözücü çıkarılana kadar döner bir evaporatörde 45 santigrat derecede buharlaştırın. Kalıntıyı bir mililitre etil asetat içinde çözün ve% 1'lik eşit hacimli trifloroasetik asit ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında bir dakika boyunca 5.000 G'de santrifüj edin ve organik tabakayı yeni bir cam tüp içinde toplayın.
Bir kılcal pipet kullanarak, TLC plakasının taban çizgisine beş mikrolitre numune ve lovastatin standartları yerleştirin ve TLC plakasının yanlarında bir santimetrelik bir sınır bırakın. Daha sonra TLC plakasını oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir duman davlumbazında kurutun. Plakayı forseps ile nazikçe mobil faz çözücüyü içeren doymuş bir cam hazneye yerleştirin.
Odayı bir cam kapakla örtün ve plakanın tamamen gelişmesine izin verin. Solvent çizgisi plakanın üstünden bir santimetreye ulaştığında plakayı odadan çıkarın. Solvent hattını bir kalemle işaretleyin ve plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca duman davlumbazında kurutun.
Kuruduktan sonra, plakayı hemen% 10 sülfürik asit çözücüye batırın ve daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca davlumbazda kurutun. Ardından, kahverengi lekeler görünene kadar plakayı ısıtma paneline yerleştirin. Plakayı mavi-LED aydınlatıcıya aktarın ve uyumlu ücretsiz yazılımı kullanarak tarayın.
Biyotahlil yönteminden elde edilen sonuçlar, inhibisyon bölgesinin boyutları ile lovastatin standartları arasındaki R karesinin 0.99 olduğunu ve regresyon modelinin öngördüğü gibi numune veriminin 0.56 miligram olduğunu göstermiştir. UV algılama yöntemi, lovastatin standartları ile TLC plakasındaki bantların boyutu arasındaki R karesinin 0.97 olduğunu ve regresyon modeli tarafından öngörülen numune veriminin 0.53 miligram olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bandın kenarları bulanıktı ve nispeten düşük sinyal yoğunluğu bantları gözlendi.
Mavi-LED aydınlatma yöntemi için, lovastatin standartları ile TLC plakasındaki bandın boyutu arasındaki R karesi 0.98 idi ve örnek verimi, regresyon modelinin öngördüğü gibi 0.54 miligram idi. Mavi-LED aydınlatıcı kullanılarak tahmin edilen verim biyotahlil yöntemine daha yakındı ve net bantlar elde edildi. Plaka aşırı ısınırsa, lovastatinin görselleştirilmesinin gözlemlenmesi zor olabilir.
