청색 LED 조명 기술을 통한 TLC 플레이트의 화합물 수율 추정

이 프로토콜은 청색 LED 조명 기술을 사용하여 TLC 플레이트에서 화합물의 수율을 추정하는 방법을 개발했습니다. 이 방법의 장점은 청색 LED 조명 기술이 안전하고 효과적이며 저렴한 방법이며 연구원이 동시에 여러 샘플을 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 생화학 및 천연물 화학에도 적용될 수 있습니다.

시작하려면 섭씨 40도에서 24 시간 동안 배양 물을 건조시킵니다. 멸균 된 핀셋을 사용하여 건조 된 배양 물을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 15 밀리리터의 에틸 아세테이트를 첨가하십시오. 혼합물을 1분 동안 볼텍싱하여 격렬하게 흔들고 200RPM에서 흔들면서 섭씨 40도에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다.

그런 다음 섭씨 40도에서 1 시간 동안 40 킬로 헤르츠 초음파 욕조를 사용하여 혼합물을 초음파 처리합니다. 다음으로, 상기 혼합물을 실온에서 1분 동안 5, 000 G에서 원심분리하고 11 마이크로미터 여과지를 통해 여과한다. 분리 깔때기에서 동일한 부피의 멸균 물로 여과액을 추출하십시오.

상 분리 후, 유기 층을 수집하고, 회전 증발기에서 증발시키고, 잔류 물을 에틸 아세테이트 2 밀리리터에 용해시킨다. 고정상으로 순상 실리카겔로 컬럼을 포장하고 이동상으로 n- 헥산 에틸 아세테이트와 트리 플루오로 아세트산을 사용합니다. 추출물 2 밀리리터를 컬럼에 넣고 이동상 용매를 분당 1 밀리리터의 유속으로 첨가하여 추출물을 용리시킵니다.

로바스타틴의 존재를 확인하기 위해 TLC로 유출물을 확인한 후 용매가 제거될 때까지 섭씨 45도의 회전 증발기에서 증발시킵니다. 잔류 물을 에틸 아세테이트 1 밀리리터에 녹인 다음 동일한 부피의 1 % 트리 플루오로 아세트산과 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 1분 동안 5, 000 G에서 원심분리하고, 새로운 유리관에 유기층을 수집한다.

모세관 피펫을 사용하여 5 마이크로리터의 샘플 및 로바스타틴 표준물질을 TLC 플레이트의 기준선 상에 스팟하고, TLC 플레이트의 측면에 1 센티미터의 경계를 남겼다. 그런 다음 TLC 플레이트를 흄 후드에서 실온에서 5 분 동안 건조시킵니다. 이동상 용매를 포함하는 포화 유리 챔버에 집게로 플레이트를 부드럽게 놓습니다.

유리 뚜껑으로 챔버를 덮고 플레이트가 완전히 발달하도록하십시오. 용매 라인이 플레이트 상단에서 1cm에 도달하면 챔버에서 플레이트를 제거합니다. 솔벤트 라인을 연필로 표시하고 실온에서 10 분 동안 흄 후드의 플레이트를 건조시킵니다.

건조 후 즉시 플레이트를 10 % 황산 용매에 담근 다음 실온에서 10 분 동안 흄 후드에서 건조시킵니다. 그런 다음 갈색 반점이 나타날 때까지 가열 패널에 플레이트를 놓습니다. 플레이트를 청색 LED 조명기로 옮기고 호환되는 프리웨어를 사용하여 스캔합니다.

생물 검정 방법에서 얻은 결과는 억제 영역과 로바스타틴 표준의 차원 사이의 R 제곱이 0.99이고 회귀 모델에 의해 예측 된 샘플 수율이 0.56 밀리그램임을 입증했다. UV 검출 방법은 로바스타틴 표준물질과 TLC 플레이트 상의 밴드 차원 사이의 R 제곱이 0.97이고, 회귀 모델에 의해 예측된 샘플 수율이 0.53밀리그램임을 보여준다. 그러나 밴드의 가장자리가 흐릿하고 상대적으로 낮은 신호 강도 밴드가 관찰되었습니다.

청색-LED 조명 방법의 경우, 로바스타틴 표준물질과 TLC 플레이트 상의 밴드 치수 사이의 R 제곱은 0.98이었고, 샘플 수율은 회귀 모델에 의해 예측된 바와 같이 0.54 밀리그램이었다. 청색 LED 조명기를 사용하여 예측된 수율은 생물학적 분석 방법에 더 가까웠고 명확한 밴드가 얻어졌습니다. 플레이트가 과열되면 로바스타틴의 시각화를 관찰하기 어려울 수 있습니다.