Dieses Protokoll entwickelte eine Methode zur Schätzung der Ausbeute von Verbindungen auf der TLC-Platte unter Verwendung der Blau-LED-Beleuchtungstechnik. Die Vorteile dieser Methode sind, dass die Blau-LED-Beleuchtungstechnik eine sichere, effektive und kostengünstige Methode ist und es dem Forscher ermöglicht, mehrere Proben gleichzeitig zu messen. Diese Methode kann auch auf die Biochemie und Naturstoffchemie angewendet werden.
Um zu beginnen, trocknen Sie die Kultur bei 40 Grad Celsius für 24 Stunden. Die getrocknete Kultur wird mit einer sterilisierten Pinzette in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt und 15 Milliliter Ethylacetat hinzugefügt. Schütteln Sie die Mischung kräftig durch Wirbeln für eine Minute und inkubieren Sie das Röhrchen für eine Stunde bei 40 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min.
Dann beschallen Sie die Mischung mit einem 40-Kilohertz-Ultraschallbad bei 40 Grad Celsius für eine Stunde. Als nächstes zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 G für eine Minute bei Raumtemperatur und filtrieren Sie durch ein 11 Mikrometer Filterpapier. Extrahieren Sie das Filtrat mit einer gleichen Menge sterilen Wassers in einem Scheidetrichter.
Nach der Phasentrennung die organische Schicht sammeln, in einem Rotationsverdampfer verdampfen und den Rückstand in zwei Milliliter Ethylacetat auflösen. Packen Sie die Säule mit normalphasigem Silikagel als stationäre Phase und verwenden Sie n-Hexanethylacetat und Trifluoressigsäure als mobile Phase. Laden Sie zwei Milliliter des Extrakts auf die Säule und fügen Sie das Lösungsmittel der mobilen Phase mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute hinzu, um den Extrakt zu eluieren.
Nachdem Sie das Abwasser durch TLC überprüft haben, um das Vorhandensein von Lovastatin zu bestätigen, verdampfen Sie in einem Rotationsverdampfer bei 45 Grad Celsius, bis das Lösungsmittel entfernt wird. Der Rückstand wird in einem Milliliter Ethylacetat gelöst und dann mit einem gleichen Volumen von 1%Trifluoressigsäure gemischt. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 G für eine Minute bei Raumtemperatur und sammeln Sie die organische Schicht in einem neuen Glasrohr.
Mit einer Kapillarpipette werden fünf Mikroliter Proben und Lovastatin-Standards auf die Grundlinie der TLC-Platte gelegt, wobei an den Seiten der TLC-Platte ein Rand von einem Zentimeter verbleibt. Anschließend trocknen Sie die TLC-Platte in einem Abzug fünf Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte vorsichtig mit einer Pinzette in eine gesättigte Glaskammer, die das Lösungsmittel der mobilen Phase enthält.
Decken Sie die Kammer mit einem Glasdeckel ab und lassen Sie die Platte vollständig entfalten. Entfernen Sie die Platte aus der Kammer, wenn die Lösungsmittellinie einen Zentimeter von der Oberseite der Platte entfernt ist. Markieren Sie die Lösungsmittellinie mit einem Bleistift und trocknen Sie die Platte im Abzug für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Nach dem Trocknen die Platte sofort in 10% igem Schwefelsäurelösungsmittel einweichen und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur im Abzug trocknen. Als nächstes legen Sie die Platte auf die Heizplatte, bis die braunen Flecken erscheinen. Übertragen Sie die Platte auf die blaue LED-Beleuchtung und scannen Sie mit kompatibler Freeware.
Die Ergebnisse der Bioassay-Methode zeigten, dass das R-Quadrat zwischen den Dimensionen der Hemmzone und den Lovastatin-Standards 0,99 betrug und die Probenausbeute 0,56 Milligramm betrug, wie vom Regressionsmodell vorhergesagt. Die UV-Detektionsmethode zeigt, dass das R-Quadrat zwischen den Lovastatin-Standards und der Dimension der Banden auf der TLC-Platte 0,97 betrug und die vom Regressionsmodell vorhergesagte Probenausbeute 0,53 Milligramm betrug. Die Ränder des Bandes waren jedoch verschwommen und es wurden relativ niedrige Signalintensitätsbänder beobachtet.
Für die Blue-LED-Beleuchtungsmethode betrug das R-Quadrat zwischen den Lovastatin-Standards und der Bandabmessung auf der TLC-Platte 0,98, und die Probenausbeute betrug 0,54 Milligramm, wie vom Regressionsmodell vorhergesagt. Die vorhergesagte Ausbeute mit dem Blue-LED-Illuminator lag näher an der Bioassay-Methode und es wurden klare Bänder erhalten. Wenn die Platte überhitzt ist, kann die Visualisierung von Lovastatin schwer zu beobachten sein.
