Ce protocole a développé une méthode pour estimer le rendement des composés sur la plaque TLC en utilisant la technique d’éclairage bleu-LED. Les avantages de cette méthode sont que la technique d’éclairage blue-LED est une méthode sûre, efficace et bon marché, et permet au chercheur de mesurer plusieurs échantillons en même temps. Cette méthode peut également être appliquée à la biochimie et à la chimie des produits naturels.
Pour commencer, séchez la culture à 40 degrés Celsius pendant 24 heures. Transférer la culture séchée dans un tube de 50 millilitres à l’aide d’une pince à épiler stérilisée et ajouter 15 millilitres d’acétate d’éthyle. Agiter vigoureusement le mélange en tourbillonnant pendant une minute et incuber le tube pendant une heure à 40 degrés Celsius en agitant à 200 tr / min.
Ensuite, soniquez le mélange à l’aide d’un bain à ultrasons de 40 kilohertz à 40 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, centrifuger le mélange à 5 000 G pendant une minute à température ambiante et filtrer à travers un papier filtre de 11 micromètres. Extraire le filtrat avec un volume égal d’eau stérile dans un entonnoir de séparation.
Après la séparation des phases, recueillir la couche organique, l’évaporer dans un évaporateur rotatif et dissoudre le résidu dans deux millilitres d’acétate d’éthyle. Emballez la colonne avec du gel de silice en phase normale comme phase stationnaire et utilisez de l’acétate d’éthyle de n-hexane et de l’acide trifluoroacétique comme phase mobile. Charger deux millilitres de l’extrait sur la colonne et ajouter le solvant en phase mobile à un débit d’un millilitre par minute pour éluer l’extrait.
Après vérification de l’effluent par TLC pour confirmer la présence de lovastatine, évaporer dans un évaporateur rotatif à 45 degrés Celsius jusqu’à ce que le solvant soit éliminé. Dissoudre le résidu dans un millilitre d’acétate d’éthyle, puis mélanger avec un volume égal d’acide trifluoroacétique à 1%. Centrifuger le mélange à 5 000 g pendant une minute à température ambiante et recueillir la couche organique dans un nouveau tube de verre.
À l’aide d’une pipette capillaire, repérez cinq microlitres d’échantillons et d’étalons de lovastatine sur la ligne de base de la plaque TLC, laissant une bordure d’un centimètre sur les côtés de la plaque TLC. Séchez ensuite la plaque TLC dans une hotte pendant cinq minutes à température ambiante. Placer doucement la plaque par pince dans une chambre en verre saturée contenant le solvant de phase mobile.
Couvrez la chambre avec un couvercle en verre et laissez la plaque se développer pleinement. Retirez la plaque de la chambre lorsque la ligne de solvants atteint un centimètre du haut de la plaque. Marquer la ligne de solvant avec un crayon et sécher la plaque dans la hotte pendant 10 minutes à température ambiante.
Après séchage, faites immédiatement tremper la plaque dans un solvant d’acide sulfurique à 10%, puis séchez dans la hotte pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, placez la plaque sur le panneau chauffant jusqu’à ce que les taches brunes apparaissent. Transférez la plaque sur l’illuminateur LED bleue et numérisez à l’aide d’un logiciel gratuit compatible.
Les résultats obtenus à partir de la méthode d’essai biologique ont démontré que le carré R entre les dimensions de la zone d’inhibition et les étalons de lovastatine était de 0,99, et que le rendement de l’échantillon était de 0,56 milligramme comme prévu par le modèle de régression. La méthode de détection UV montre que le carré R entre les étalons de lovastatine et la dimension des bandes sur la plaque TLC était de 0,97, et le rendement de l’échantillon prédit par le modèle de régression était de 0,53 milligramme. Cependant, les bords de la bande étaient flous et des bandes d’intensité du signal relativement faibles ont été observées.
Pour la méthode d’éclairage à LED bleues, le carré R entre les étalons de lovastatine et la dimension de la bande sur la plaque TLC était de 0,98, et le rendement de l’échantillon était de 0,54 milligramme comme prévu par le modèle de régression. Le rendement prévu à l’aide de l’illuminateur à LED bleue était plus proche de la méthode d’essai biologique et des bandes claires ont été obtenues. Si la plaque est surchauffée, la visualisation de la lovastatine peut être difficile à observer.
