Questo protocollo ha sviluppato un metodo per stimare la resa dei composti sulla piastra TLC utilizzando la tecnica di illuminazione blu-LED. I vantaggi di questo metodo sono che la tecnica di illuminazione blu-LED è un metodo sicuro, efficace ed economico e consente al ricercatore di misurare più campioni contemporaneamente. Questo metodo può anche essere applicato alla biochimica e alla chimica dei prodotti naturali.
Per iniziare, asciugare la coltura a 40 gradi Celsius per 24 ore. Trasferire la coltura essiccata in un tubo da 50 millilitri utilizzando una pinzetta sterilizzata e aggiungere 15 millilitri di acetato di etile. Agitare vigorosamente la miscela vorticando per un minuto e incubare il tubo per un'ora a 40 gradi Celsius agitando a 200 giri/min.
Quindi sonicare la miscela usando un bagno ad ultrasuoni da 40 kilohertz a 40 gradi Celsius per un'ora. Quindi, centrifugare la miscela a 5.000 G per un minuto a temperatura ambiente e filtrare attraverso una carta da filtro da 11 micrometri. Estrarre il filtrato con un volume uguale di acqua sterile in un imbuto separatore.
Dopo la separazione di fase, raccogliere lo strato organico, farlo evaporare in un evaporatore rotante e sciogliere il residuo in due millilitri di acetato di etile. Imballare la colonna con gel di silice in fase normale come fase stazionaria e utilizzare l'acetato di etile n-esano e l'acido trifluoroacetico come fase mobile. Caricare due millilitri dell'estratto sulla colonna e aggiungere il solvente in fase mobile ad una portata di un millilitro al minuto per eluire l'estratto.
Dopo aver verificato l'effluente mediante TLC per confermare la presenza di lovastatina, evaporare in un evaporatore rotante a 45 gradi Celsius fino a quando il solvente non viene rimosso. Sciogliere il residuo in un millilitro di acetato di etile e quindi mescolare con un volume uguale di acido trifluoroacetico all'1%. Centrifugare la miscela a 5.000 g per un minuto a temperatura ambiente e raccogliere lo strato organico in un nuovo tubo di vetro.
Utilizzando una pipetta capillare, individuare cinque microlitri di campioni e standard di lovastatina sulla linea di base della piastra TLC, lasciando un bordo di un centimetro sui lati della piastra TLC. Quindi asciugare la piastra TLC in una cappa aspirante per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare delicatamente la piastra mediante una pinza in una camera di vetro satura contenente il solvente di fase mobile.
Coprire la camera con un coperchio di vetro e lasciare che la piastra si sviluppi completamente. Rimuovere la piastra dalla camera quando la linea dei solventi raggiunge un centimetro dalla parte superiore della piastra. Segnare la linea del solvente con una matita e asciugare la piastra nella cappa aspirante per 10 minuti a temperatura ambiente.
Dopo l'essiccazione, immergere immediatamente la piastra in solvente di acido solforico al 10%, quindi asciugare nella cappa aspirante per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, posizionare la piastra sul pannello riscaldante fino a quando non compaiono le macchie marroni. Trasferire la piastra sull'illuminatore blu-LED e scansionarla utilizzando freeware compatibile.
I risultati ottenuti dal metodo del saggio biologico hanno dimostrato che il quadrato R tra le dimensioni della zona di inibizione e gli standard di lovastatina era 0,99 e la resa del campione era di 0,56 milligrammi come previsto dal modello di regressione. Il metodo di rilevamento UV mostra che il quadrato R tra gli standard di lovastatina e la dimensione delle bande sulla piastra TLC era 0,97 e la resa del campione prevista dal modello di regressione era di 0,53 milligrammi. Tuttavia, i bordi della banda erano sfocati e sono state osservate bande di intensità del segnale relativamente basse.
Per il metodo di illuminazione blu-LED, il quadrato R tra gli standard di lovastatina e la dimensione della banda sulla piastra TLC era 0,98 e la resa del campione era di 0,54 milligrammi come previsto dal modello di regressione. La resa prevista utilizzando l'illuminatore blu-LED era più vicina al metodo del saggio biologico e sono state ottenute bande chiare. Se la piastra è surriscaldata, la visualizzazione della lovastatina può essere difficile da osservare.
