Agradecemos a Shanghai Tolo Biotech por sua assistência técnica durante o desenvolvimento do padrão C-Brick. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (Grant No. XDB19040200).

1. Preparação de crRNA <ol><li> Preparação de modelos CRRNA <ol><li> Re-suspenda os oligonucleótidos individuais ( Tabela 1 ) em água sem RNase até uma concentração de 10 uM. </li><li> Adicionar 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia superior (T7-F na Tabela 1 ), 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia inferior ( Tabela 1 ) e 5 μL de tampão de recozimento 10x a um tubo de PCR de 0,2 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL. NOTA: Seis diferentes oligonucleótidos de cadeia inferior são mostrados na Tabela 1 , cada um dos quais deve ser emparelhado individualmente com a T7-F de topo. As letras minúsculas na Tabela 1 representam a sequência a transcrever para a sequência guia de crRNA. 10x Taq PCR buffer pode ser usado em vez do 10x annealing buffer. </li><li> Coloque o tubo de PCR em um termociclador. </li><li> Execute o programa de recozimento: desnaturação inicial a 95 ° C para5 min e depois um tempo de enchimento de 95-20 ° C, com uma diminuição de 1 ° C por minuto no termociclador. NOTA: Imediatamente use as amostras para o passo 1.2.1. </li></ol></li><li> Transcrição e purificação de crRNA <ol><li> Adicionar 38 μL de água sem RNase, 8 μL do molde do passo 1.1.4, 20 μL de tampão de transcrição 5x T7, 20 μL de mistura de NTP (10 μM), 4 μL de inibidor de RNase recombinante (RRI) e 10 ΜL de polimerase de ARN T7 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 100 μL. </li><li> Coloque o tubo de microcentrífuga em banho-maria a 37 ° C durante a noite (por cerca de 16 h). </li><li> Use um kit de limpeza e concentração de ARN para purificar o ARN transcrito; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Quantificar os RNAs com espectrofotômetros UV-Vis e diluir o RNA para uma concentração de 10 μM. Use as amostras imediatamente ou guarde-as a -80 ° C. NOTA: A sequência crRNAS estão listados na Tabela 2 . </li></ol></li></ol> 2. Construção de peças de C-Brick ( ou seja, a inserção de peças biológicas em um vetor padrão de C-Brick) NOTA: Esta etapa tem três sub-etapas. Para partes biológicas curtas ( por exemplo, promotores e terminadores), é melhor usar o método de PCR direta para inserir as partes biológicas em um vetor padrão C-Brick 4 . Toda a sequência do vetor é mostrada nos dados suplementares, e a seqüência de prefixo e sufixo é mostrada na Figura 1 (etapa 2.1, abaixo). Para as partes biológicas que podem ser facilmente obtidas através da PCR ( por exemplo, com modelos de DNA genômico, plasmídeos ou sequências de DNA sintetizadas de novo ), é melhor usar o método de montagem sem costura para inserir as partes biológicas em um vetor padrão C-Brick (Passo 2.2, abaixo). Para as peças obtidas dos padrões BioBrick e BglBrick, a restriçãoA digestão mediada por enzima e a ligação mediada por ligadura de ADN de T4 podem ser utilizadas para inserir as partes biológicas num vector padrão C-Brick (passo 2.3, abaixo). <ol><li> Construção via amplificação direta de PCR <ol><li> Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR. NOTA: O extremo 5 &#39;do oligonucleótido contém a sequência da parte do DNA e a extremidade 3&#39; do oligonucleótido contém a sequência do vetor ( isto é, &quot;GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG&quot; na extremidade 3 &#39;da cadeia dianteira e &quot;GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG&quot; Na cadeia inversa). Ou nenhum saliência ou uma saliência de ~ 20 pb podem ser concebidos no extremo 5 &#39;do oligonucleótido. Exemplos específicos podem ser encontrados em um estudo anterior 4 . </li><li> Re-suspenda os oligonucleótidos individuais em água ultra pura até uma concentração de 10 μM. </li><li> Configure as reações de PCR no gelo em um tubo de PCR de 0,2 mL: adicione 18 μL de água ultra pura, 25 μL de 2x PCR buffer, 1 μL de dNTPs (10 μM), 2,5 μL de cada um dos iniciadores direto e reverso (10 μM) do passo 2.1.2, 0,5 μL de vetor padrão C-Brick (50 ng) como modelo e 0,5 μL De polimerase de DNA de alta fidelidade. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL. </li><li> Coloque o tubo diretamente em um termociclador e comece o programa termociclador. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li><li> Programa Thermocycler: um ciclo durante 3 min a 98 ° C; Trinta ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C e 2 min a 72 ° C; E um ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenha a amostra a 16 ° C. </li><li> Adicione 9 μL da mistura do passo 2.1.4 a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Adicione 1 μL de DpnI e incube durante 1 h num banho de água a 37 ° C. NOTA: Se os primers não tiverem seqüências sobrepostas, adicione 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4 (PNK) e 0,5 μL de T4 DNA ligase e incubar emUm banho de água a 22 ° C durante 1 h. Caso contrário, se os iniciadores contiverem uma seqüência de sobreposição de ~ 20 nt, transformar diretamente os produtos tratados com DpnI em células compatíveis com E. coli (DH10B) (etapa 2.4). O produto de PCR linearizado será circularizado pelo sistema de recombinação no hospedeiro. </li><li> Use as amostras imediatamente ou guarde-as a -20 ° C. </li></ol></li><li> Construção através de montagem sem costura <ol><li> Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR. NOTA: A extremidade 3 &#39;do oligonucleótido contém a sequência terminal da parte de DNA e a extremidade 5&#39; do oligonucleótido contém o terminal da sequência de vetor padrão linear C-Brick ( ou seja, &quot;CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC&quot; para o 5 &#39; -end da cadeia direta e &quot;CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC&quot; para o extremo 5 &#39;da cadeia reversa). Exemplos específicos podem ser encontrados em um estudo anterior 4 . </li><li> Re-suspenda os indivíduosOligonucleótidos ual em água ultra pura para uma concentração de 10 μM. </li><li> Configure as reações de PCR no gelo em um tubo de PCR de 0,2 mL: adicione 18 μL de água ultra pura, 25 μL de tampão de PCR 2x, 1 μL de dNTPs (10 μM), 2,5 μL cada um dos iniciadores direto e reverso (10 μM ) A partir do passo 2.2.2, 0,5 μL de molde (20-500 ng) e 0,5 μL de DNA-polimerase de alta fidelidade. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL. </li><li> Coloque o tubo diretamente no termociclador e execute o programa termociclador. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. NOTA: Configure o programa do termociclador para: um ciclo durante 3 min a 98 ° C; 30 ciclos por 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (de acordo com a temperatura de recozimento do primário) e 1 min (de acordo com o comprimento das partes biológicas) a 72 ° C; E um ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenha a amostra a 16 ° C. </li><li> Purificar o produto de PCR usando um sistema de limpeza por PCRKit tem; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Digerir o vetor padrão C-Brick com BamHI: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (1 μg), 5 μL de tampão 10x e 1 μL de BamHI ao tubo de microcentrífuga. Incubar até 2 h a 37 ° C num banho de água. </li><li> Purifique o produto acima usando um kit de sistema de limpeza de gel; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Adicione 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.2.7, 5 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.2.4, 2 μL de tampão de montagem sem costura de 5x e 1 μL de enzima de montagem sem costura a partir de um kit de montagem sem costura Para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 10 μL. </li><li> Coloque isso em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li></ol></li><li> Construção por meio de digestão com restrição de medição enzimática e ligadura mediada por DNA ligase de T4. NOTA: Para as peças obtidas dos padrões BioBrick (passo 2.3.4-2.3.7) e BglBrick (passo 2.3.1-2.3.3), a digestão mediada por enzimas de restrição e a ligadura mediada por DNA ligase T4 pode ser usada para inserir a Partes biológicas em um vetor padrão C-Brick. <ol><li> Digerir as partes padrão BglBrick com BamHI e BglII: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (2 μg), 5 μL de 10x tampão 3, 0,5 μL de BamHI e 0,5 μL de BglII ao tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C. </li><li> Execute uma eletroforese em gel de agarose a 1% e purifique o fragmento usando um kit de sistema de limpeza de gel. </li><li> Ligar o fragmento e o vetor padrão C-Brick: adicionar 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.1.12 e 6 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.3.3 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de 10 x T4 DNA ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou livreE armazená-los a -20 ° C. </li><li> Digite as peças padrão BioBrick com XbaI e SpeI: adicione 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (2 μg), 5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de XbaI e 0,5 μL de SpeI no tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C. </li><li> Digerir o vetor padrão C-Brick com XbaI e SpeI: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (1 μg), 5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de XbaI e 0,5 μL de SpeI no tubo de microcentrífuga . Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C. </li><li> Execute uma eletroforese em gel de agarose a 1% e purifique o fragmento do passo 2.3.4 e o vetor linearizado a partir do passo 2.3.5 com um kit de sistema de limpeza de gel; Seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Ligar o fragmento e o vetor C-Brick: adicionar 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.3.5 e 6 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.3.4 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. de AnúnciosD 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li></ol></li><li> Adicione 10 μL dos produtos do passo 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 ou 2.3.7 para a transformação química nas células competentes de E. coli (DH10B). </li><li> Levar vários clones para um tubo Luria-Bertani (LB) líquido de 5 mL e incubar a 37 ° C num agitador (220 rpm) durante a noite. </li><li> Extrair o plasmídeo usando um kit de preparação de plasmídeo; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Identifique os clones corretos pelo seqüenciamento do Sanger 11 . </li></ol> 3. Conjunto C-Brick ( Figura 2 ) <ol><li> Digestão do vetor C-Brick com Cpf1 <ol><li> Adicionar 22,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL do plasmídeo do passo 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI e 1 &amp;# 181; L de Cpf1 (5 μM) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: Cpf1 pode ser comprado comercialmente ou purificado após o protocolo em um estudo anterior 4 . </li><li> Para inserir um fragmento de ADN estranho nos locais T1 e T2, adicionar 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) e incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Um dd 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) e Cpf1 (5 μM) por mais 30 min. NOTA: Alternativamente, para inserir um fragmento de DNA estranho nos locais T3 e T4, adicionar 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) e incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Adicione 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) por mais 30 min. </li><li> Adicione 1 μL de fosfatase alcalina termossensível e incuba o tubo em um banho de água a 37 ° C durante mais 1 h. </li><li> Execute uma eletroforese em gel de agarose e purifique o vetor usando um kit de sistema de limpeza de gel. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li></ol></Li&gt; <li> Digestão do fragmento de DNA com Cpf1 <ol><li> Adicionar 21,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL de plasmídeo a partir do passo 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI e 2 μL de Cpf1 (5 μM) a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Para inserir um fragmento de DNA estranho nos locais T1 e T2, adicione 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) e 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) e incube em banho-maria a 37 ° C durante 2 h. NOTA: Alternativamente, adicione 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) e 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) e incube em banho-maria a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Execute uma eletroforese em gel de agarose e purifique o fragmento usando um kit de sistema de limpeza de gel. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li></ol></li><li> Assembléia de C-Brick e verificação adicional <ol><li> Ligar o fragmento de ADN estranho e o vetor C-Brick: adicionar 2 μL do vetor linearizado (50 ng) do passo 3.1.4 e 6 μL do fragmento de ADN (200 ng) do passo 3.2.3 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li><li> Adicionar 10 μL dos produtos de ligação (passo 3.3.1) para a transformação química em células compatíveis com E. coli (DH10B). </li><li> Adicione vários clones a um tubo LB líquido de 5 mL e incube durante a noite em um agitador a 220 rpm e 37 ° C. </li><li> Extrair o plasmídeo usando um kit de preparação de plasmídeo; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Identificar clones corretos pelo seqüenciamento do Sanger 11 . </li></ol></li><li> Execute uma nova rodada de montagem C-Brick. Os clones corretos do passo 3.3.4 podem ser usados ​​como um novo vetor C-Brick ou parte de DNA para uma montagem iterativa adicional de C-Brick, seguindo o mesmo protocolo das etapas 3.1-3.3. NOTA: T2 &#39;e T3&#39; sSão projetados como o backup de sites T2 e T3 ( Figura 1a ). Para os plasmídeos obtidos a partir do passo 2.3.7, apenas T2 e T3 podem ser utilizados para a montagem padrão do C-Brick. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um procedimento para o padrão de montagem de DNA C-Brick. O passo mais importante neste protocolo é a linearização do vetor padrão C-Brick; A clivagem incompleta do vetor pode afetar seriamente a taxa de sucesso. Além disso, embora o Cpf1 cliva principalmente as sequências de DNA alvo no padrão de clivagem &quot;18-23&quot;, também foi detectada uma clivagem incorreta perto das duas bases 4 , o que pode causar um pequeno número de mutações após a montagem do D...

A padronização de partes biológicas do DNA é importante para o desenvolvimento da biologia sintética 1 . O desenvolvimento de um procedimento de montagem de DNA pode substituir projetos experimentais ad hoc e remover muitos dos resultados inesperados que ocorrem durante a montagem de componentes genéticos em sistemas maiores. O padrão BioBrick (BBF RFC 10) foi um dos primeiros padrões de montagem de DNA propostos. Ele usa a seqüência de prefixo (contendo sites de corte EcoRI e XbaI) e a seqüência de sufixos (contendo sites de corte SpeI e PstI) 2 , 3 . Como XbaI e SpeI têm extremidades coesivas complementares, as partes de DNA BioBrick que são cortadas com XbaI e SpeI podem ser unidas, gerando um novo BioBrick para uma montagem iterativa adicional. Alguns defeitos foram identificados com o uso do padrão BioBrick 4 . Por exemplo, produz uma cicatriz de 8 pbEntre as partes de DNA, o que não permite a construção de proteínas in-fusion. Além disso, os quatro tipos acima mencionados de sites de restrição de 6 pb devem ser removidos das partes de DNA, o que é muito inconveniente. O padrão BglBrick foi estabelecido para resolver o primeiro problema 5 . Ele cria uma cicatriz &quot;GGATCT&quot; de 6 pb, produzindo Gly-Ser e permitindo a fusão de múltiplas proteínas ou domínios protéicos. IBrick foi desenvolvido para lidar com o segundo problema 6 . Ele usa endonucleases homing (HEs) que reconhecem longas seqüências de DNA. Como os sites de reconhecimento HE raramente existem em seqüências de DNA naturais, o padrão iBrick pode ser usado para a construção direta de peças iBrick sem modificar suas seqüências de DNA. No entanto, o padrão iBrick deixa uma cicatriz de 21 pb entre as partes do DNA, o que pode ser o motivo da sua impopularidade. Nos últimos anos, as repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas agrupadas (CRISPR) foi desenvolvido rapidamente 7 , 8 . Entre as proteínas associadas a CRISPR (Cas), a endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes é amplamente utilizada. Ele apresenta principalmente interrupções de DNA de cadeia dupla (DSBs) com extremidades sem corte 9 . Em 2015, Zhang e colaboradores caracterizaram o Cpf1 (CRISPR da Prevotella e Francisella 1) pela primeira vez. Ele pertence ao sistema CRISPR-Cas da classe 2 do tipo V e é uma endonuclease 10 CRISRP RNA (crRNA). Ao contrário de Cas9, o Cpf1 apresenta um DSB com uma subida de 5 ou 5 nt 5 &#39;10. Com base nessa característica, Cpf1 foi usado para desenvolver um padrão de montagem de DNA, C-Brick 4 . Em um vetor padrão C-Brick, quatro locais alvo Cpf1 de T1 / T2 prefixados e T3 / T4 sufixos flanqueiam as partes biológicas; Isso é semelhante ao padrão BioBrick. Como a divisão dos sites T2 e T3 pRoduces extremidades adesivas complementares, é possível realizar a montagem iterativa de partes de DNA ao gerar uma cicatriz &quot;GGATCC&quot; entre as partes. Notavelmente, o padrão C-Brick tem duas vantagens principais: reconhecendo longas sequências alvo e deixando cicatrizes curtas. A cicatriz de 6 pb &quot;GGATCC&quot; gerada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite a construção de proteínas de fusão. Além disso, o padrão C-Brick também é parcialmente compatível com os padrões BglBrick e BioBrick.

<table><tbody><tr><td>Comercial Oligonucleotide</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA Transcription Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>NTP mixture</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (Recombinant RNase Inhibitor)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max Buffer</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR buffer</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax for One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>seamless assembly kit</td></tr><tr><td>5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV Gel and PCR clean-up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>plasmid preparation kit</td></tr><tr><td>thermosensitive alkaline phosphatase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 buffer</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick standard vector</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (tryptone)</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (yeast extract)</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (NaCl)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

A proteína Cpf1 associada ao CRISPR cliva o DNA de cadeia dupla sob a orientação do ARN CRISPR (crRNA), gerando extremidades pegajosas. Por causa desta característica, o Cpf1 tem sido usado para o estabelecimento de um padrão de montagem de DNA chamado C-Brick, que tem a vantagem de longos sites de reconhecimento e cicatrizes curtas. Em um vetor C-Brick padrão, existem quatro sites de reconhecimento Cpf1 - o prefixo (sites T1 e T2) e o sufixo (sites T3 e T4) - partes biológicas de DNA flanqueando. A clivagem dos locais T2 e T3 produz extremidades adesivas complementares, que permitem a montagem de partes de DNA com sites T2 e T3. Enquanto isso, uma pequena cicatriz &quot;GGATCC&quot; é gerada entre partes após a montagem. À medida que o plasmídeo recém-formado contém novamente os quatro locais de clivagem Cpf1, o método permite a montagem iterativa de partes de DNA, que é semelhante à dos padrões BioBrick e BglBrick. Um procedimento descrevendo o uso do padrão C-Brick para montar peças de DNAÉ descrito aqui. O padrão C-Brick pode ser amplamente utilizado por cientistas, estudantes de graduação e graduação e até amadores.

<html> Este protocolo demonstrou a montagem de três cassetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) e amilGFP (BBa_K592010)). Primeiro, as sequências de codificação dos três genes e terminadores acima mencionados foram clonados individualmente em um vetor padrão C-Brick. Pequenas partes de DNA, promotor e terminador, foram introduzidas no vetor C-Brick através de amplificação por PCR usando primers contendo as partes de DNA curtas no terminal 5 &#39;. Segu...

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

A proteína Cpf1 associada ao CRISPR pode ser guiada por um ARN CRISPR especialmente concebido (crRAR) para escindir o DNA de cadeia dupla nos locais desejados, gerando extremidades pegajosas. Com base nessa característica, foi estabelecido um padrão de montagem de DNA (C-Brick), e um protocolo que detalha seu uso é descrito aqui.

Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

protocols-for-c-brick-dna-standard-assembly-using-cpf1

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K visualizações.  Chinese Academy of Sciences.  A proteína Cpf1 associada ao CRISPR pode ser guiada por um ARN CRISPR especialmente concebido (crRAR) para escindir o DNA de cadeia dupla nos locais desejados, gerando extremidades pegajosas. Com base nessa característica, foi estabelecido um padrão de montagem de DNA (C-Brick), e um protocolo que detalha seu uso é descrito aqui. 

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A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Um kit de ferramentas para permitir a conversão de hidrocarbonetos em ambientes aquosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Bioengenharia

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic engineering became applicable to a large range of systems. Moreover, many transcriptional and epigenomic engineering approaches are now generally feasible for the first time. One reason for the broad applicability of CRISPR lies in its bipartite nature. Small gRNAs determine the genomic targets of the complex, variants of the protein Cas9, and the local molecular consequences. However, many CRISPR approaches depend on the simultaneous delivery of multiple gRNAs into individual cells. Here, we present a customizable protocol for string assembly gRNA cloning (STAgR), a method that allows the simple, fast and efficient generation of multiplexed gRNA expression vectors in a single cloning step. STAgR is cost-effective, since (in this protocol) the individual targeting sequences are introduced by short overhang primers while the long DNA templates of the gRNA expression cassettes can be re-used multiple times. Moreover, STAgR allows single step incorporation of a large number of gRNAs, as well as combinations of different gRNA variants, vectors and promoters.

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Here, we present string assembly gRNA cloning (STAgR), a method to easily multiplex gRNA vectors for CRISPR/Cas9 approaches. STAgR makes gRNA multiplexing simple, efficient and customizable.

Um protocolo personalizáveis para String Assembly gRNA clonagem (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Genética

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) is used to fix chromatin interactions. Then, chromatin digestion with a restriction enzyme and subsequent religation of fragment ends converts three-dimensional (3D) proximity into unique ligation products. Finally, after reversal of crosslinks, protein removal, and DNA isolation, DNA is sheared and prepared for high-throughput sequencing. The frequency of proximity ligation of pairs of loci is a measure of the frequency of their colocalization in three-dimensional space in a cell population.
A sequenced Hi-C library provides genome-wide information on interaction frequencies between all pairs of loci. The resolution and precision of Hi-C relies on efficient crosslinking that maintains chromatin contacts and frequent and uniform fragmentation of the chromatin. This paper describes an improved in situ Hi-C protocol, Hi-C 3.0, that increases the efficiency of crosslinking by combining two crosslinkers (formaldehyde [FA] and disuccinimidyl glutarate [DSG]), followed by finer digestion using two restriction enzymes (DpnII and DdeI). Hi-C 3.0 is a single protocol for the accurate quantification of genome folding features at smaller scales such as loops and topologically associating domains (TADs), as well as features at larger nucleus-wide scales such as compartments.

Hi-C 3.0 is an improved Hi-C protocol that combines formaldehyde and disuccinimidyl glutarate crosslinkers with a cocktail of DpnII and DdeI restriction enzymes to increase the signal-to-noise ratio and the resolution of chromatin interaction detection.

Capturando a Conformação Cromossômica Através de Escalas de Comprimento

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Química

Captura de Conformação Cromossômica (3C) para Pesquisa e Ensino de Graduação

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Autor em destaque: Obtendo um A com os 3Cs: Captura de conformação cromossômica para alunos de graduação  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Design e síntese de um Rack de acordeão de DNA reconfigurável

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering Construções recombinação homóloga em<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

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Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

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