Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц

Резюме

Nanodiscs малых дисковидные частицы, которые включают мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Мы предоставляем визуальный протокол, который показывает, шаг за шагом включения MalFGK2 транспортера на диск.

Аннотация

Nanodisc является дисковидные частицы (~ 10-12 нм большой), что ловушка мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Nanodisc является особенно привлекательным вариантом для исследования мембранных белков, особенно в контексте лиганд-рецепторных взаимодействий. Метод пионером Sligar и коллегами основана на амфипатическими свойства разработаны высоко-спиральной эшафот белок, полученный из аполипопротеина A1. Гидрофобные лица белка эшафот взаимодействовать с ацил боковых цепей липидного бислоя в то время как полярные регионы сталкиваются с водной средой. Анализы мембранных белков в nanodiscs имеют значительные преимущества по сравнению с липосомами, поскольку частицы мелкие, однородные и растворимые в воде. Кроме того, биохимических и биофизических методов обычно зарезервированы для растворимых белков могут быть применены, и по обе стороны от мембраны. В этой визуальной протокол, мы представляем шаг за шагом, восстановление и характеристикиризуется бактериальных транспортеров ABC, мужчины MalFGK ₂ комплекса. Формирование диска процесса самосборки, что зависит от гидрофобных взаимодействий, происходящих в ходе постепенного устранения моющего средства. Мы опишем основные шаги, и мы подчеркиваем важность выбора правильного белок-липидного соотношения для того, чтобы ограничить образование агрегатов и больше полидисперсных липосомы частицы. Простой контроля качества, такие как гель-фильтрации хроматографии, родной гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света убедиться, что диски были должным образом восстановлена.

протокол

Общий процесс разведения

Начнется процесс восстановления путем смешивания мембраны эшафот белка (MSP) с очищенной MalFGK ₂ комплекса в присутствии детергента солюбилизированной фосфолипидов. Этот шаг последующим медленным удаления моющего средства по адсорбента материала полистирола называется Bio-Beads или Amberlite (рис. 1). Автоматический процесс сборки происходит, скорее всего, из-за аполярная взаимодействия между гидрофобными фосфолипидов, MalFGK ₂ комплекса и поверхности MSP амфипатическими белка. Конечный продукт представляет собой дисковидные частицы состоят из двух молекул упаковки MSP вокруг MalFGK ₂ комплекса. Частицы отделяются от аддуктов и агрегатов ультра-центрифугирования и аналитической гель-хроматографии. Частицы характеризуются родной-гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света.

Название "> 1. Подготовка мембранных белков леса, MSP

1. Его с метками MSP (версия MSP1D1 ¹⁾ производится из плазмиды pMSP1D1 в E. палочки BL21 (DE3), индуцированного на OD ₆₀₀ ~ 0,5 с 0,5 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид в течение 3 часов при 37 ° C.
2. Клетки собирают центрифугированием при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° C и ресуспендировали в TSG10 буфера, содержащего 100 мкМ phenylmethanesulfonyl фтора.
3. Клетки лизируют с французской прессы (3x) в 8000 фунтов на квадратный дюйм и нерастворимые вещества удаляют центрифугированием при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Растворимые фракции, содержащей MSP выделяют ультра-центрифугирования при 125000 х г в течение 45 мин.
4. MSP очищают никель-хелатирующей хроматографии с использованием ~ 1,5 мл Ni сефарозой HP в TSG10 буфера. Загрязняющие вещества вымываются с TSG10 буфера, содержащего 50 мМ имидазола. MSP элюируют TSG10 буфера, содержащего 600 мМимидазола. Очищенный белок диализовали в TSG10 буфер и хранится в -70 ° С при концентрации белка ~ 10-15 мг / мл.

2. Подготовка MalFGK ₂ комплекс

1. MalFGK ₂ комплекса, его метками на С-конце Malk, выражается из плазмиды pBAD22-FGK в E. палочки BL21 (DE3) и индуцированные на OD ₆₀₀ ~ 0,5 с 0,2% L-арабинозы в течение 3 часов при 37 ° C.
2. После лизиса клеток и центрифугирования, как в пункте 1.3, мембраны осадок ресуспендируют в TSG20 буфера при конечной концентрации 5 мг / мл. Материал растворяется с 1% в / о N-додецил-β-maltopyranoside (DDM) в течение 3 ч при 4 ° С при осторожном встряхивании.
3. Нерастворимый материал удаляется с помощью ультра-центрифугирования, как и в шаге 1.3 и супернатант, содержащий солюбилизированной MalFGK ₂ комплекса собирают и очищают, как в пункте 1.4, но без диализа.
4. FurtheГ очистка достигается путем гель-фильтрации в TSGD буфера на Superdex 200 HR 10/300 столбцов при скорости потока 0,5 мл / мин.

3. Подготовка Фосфолипиды

1. E. палочки общего липидного экстракта растворяют в хлороформе отделяется в 1000 нмоль аликвоты в пробирках винтовой крышкой отцентрифугировать. Растворитель выпаривают при слабой струей азота и сушат дальнейшее течение ночи в вакуумном эксикаторе.
2. Липидную пленку растворяли в буфере TS на 5 нМ конечной концентрации и встряхивали энергично и ультразвуком. Растворяют липиды появится слегка матовой из-за их общей неразрешимости в водном буфере TS, но они должны оставаться во взвешенном состоянии. DDM добавляют до конечной концентрации 0,5% (~ 10 мм), при которой раствор становится прозрачным.
3. Липидов смесь помещают на водяную баню и пульс обрабатывали ультразвуком в течение 5 раз за 5 сек. Липидную смесь хранится при температуре 4 ° С в течение максимум 1 крошечныйк.

4. Подготовка Bio-Beads

1. Примерно 10-15 мл (объем сухого) Bio-Beads помещают в 50 мл трубки.
2. Бисер последовательно промывали 50 мл 100% метанола, 95% этанола, MilliQ H ₂ O, и, наконец, TS буфера (два раза).
3. Промытый бисером хранятся при температуре 4 ° C в ~ 10 мл буфера TS.

5. Восстановление Nanodisc

1. MSP разводят в TSGD буфера при конечной концентрации ~ 7 мг / мл (~ 0,3 мм).
2. ~ 2 нмоль очищенного MalFGK ₂ комплекса смешивают при белка: MSP: липидный отношение 1:3:60 или 1:3:400 в TSGD буфера. Конечная концентрация составляет 6 мкм MalFGK _2, 18 мкМ MSP и 360 мкМ липидов (1:3:60) или 2,4 ммоль липидов (1:3:400). Конечный объем составляет 300 мкл. Конечная концентрация DDM составляет 0,08% (~ 1,6 мм). Конечная концентрация глицерина зависит от количества липидов добавил, но остается около 5-10% V / v
3. ~ 50 мкл Bio-Bead суспензии добавляют в пробирку, и смесь инкубировали в течение ночи на качающейся таблицы при 4 ° C.
4. Бисер осаждают тяжести и решения пипеткой через узкий наконечник, чтобы избегать, насколько Bio-Beads насколько это возможно.
5. Большая осадка удаляются ультра-центрифугирования при 100000 х г в течение 20 мин. Диски очищают с помощью гель-фильтрации, как в пункте 2.4 в TSG10 буфера. Фракции, содержащие диски объединяются и аликвоты должны закачиваться на той же колонке гель-фильтрации для проверки стабильности препарата.
6. Очищенные диски могут храниться при -70 ° C в течение длительного периода времени. После оттаивания на льду, диски должны быть подвергнуты ультра-центрифугирования, как и в шаге от 5,5 до устранения потенциальных осадков. Аликвоты должны быть проанализированы гель-фильтрации, чтобы гарантировать, что значительная агрегация или осадки не происходят во время оттаиванияпроцесса.

6. Родные гель-электрофореза

1. 1 мкМ nanodiscs (~ 0,2 мг / мл) анализируют родной стр. ^{6, 7} (Трис-HCl, рН 8,8, 4-12%) для оценки качества восстановления (рис. 3А).
2. Связывание мужчин (1 мкМ) в MalFGK _{2-комплекса} воссоздана в nanodiscs также оценивается по родным-PAGE (рис. 3А).
3. После электрофореза гель окрашивали кумасси синим в течение 10 мин, и обесцвечивают в течение ~ 1 часа.

7. Динамического рассеяния света (DLS)

1. Nanodiscs очищают гель-фильтрации, как в пункте 2.4 в TSG10 буфера, используя Superdex 200 HR 10/300 столбцов при скорости потока 0,1 мл / мин. Фракции, содержащие nanodiscs объединяют и концентрируют до ~ 10 мг / мл с Amicon центробежного фильтра.
2. Образец фильтруют дважды (0,22 мкм) до анализа DLS использованияDynapro nanostar инструмента (Wyatt Technology) в 1 мкл внутреннего объема кварцевых кювет. Данные устанавливается с помощью динамика программного обеспечения (Wyatt Technology) для оценки диаметра и молекулярной массы частиц.

8. АТФазы Измерения

1. АТФазы MalFGK _{2-восстановленного} nanodiscs определяется с использованием колориметрического анализа ^8.
2. 1 мкМ очищенных дисков и 1 мМ ATP смешивают с увеличением количества мужчин и инкубировали при 37 ° С в течение 20 мин. Освобождение неорганического фосфата измеряется при 660 нм.
3. Количество высвобожденного фосфата по сравнению с стандартной кривой, полученной с раствором Стандартный фосфора.

9. Представитель Результаты

Nanodiscs очищают гель-фильтрации хроматографии (рис. 2А, слева). Хроматограмма показывает, что большинство из восстановленного DISCS (черный след) элюируются как единый пик, в то время как диски сделаны с избытком липидов (красный след) элюируются в свободном объеме и в серии широких пиков. Качество nanodiscs далее анализируются родной гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света (DLS). Правильно восстановленный диск миграцию как резкое полосы на геле в то время как те, восстановленный в присутствии избытка липидов мигрировать в мазке (рис. 2A, справа). Анализ показывает, что DLS диск население является однородным со средним диаметром 11,4 нм (рис. 2В). Восстановленные диски имеют молекулярную массу в 215 кДа на основе приближения DLS. Образцы воссоздана в присутствии избытка липидов дисплей широко распространены радиусы около 100 нм, что характерно для неоднородных образцов.

Качество MalFGK ₂ комплекса оценивается по родным-гель-электрофореза и его деятельность АТФазыизмерений (рис. 3). Мальтоза обязательной мужской белок связывается с высоким сродством к MalFGK ₂ транспортера ^{9, 10.} Использование неденатурирующем гель-электрофореза, можно обнаружить сложную между мужчиной и MalFGK ₂ (рис. 3А). Стимулирование Malk ₂ АТФазы мужского показано на рисунке 3b.

Рисунок 1. Типичная схема для восстановления протокола.

Рисунок 2. Контроль качества nanodisc подготовки. A. Гель-фильтрация анализа (Superdex 200 HR 10/300 столбца) nanodiscs восстановленные при низком соотношении липидов (1/3/60, черный след) или высоким соотношением липидов (1/3/400, красный след). Родные гель-электрофореза одного и того же препарата диска. Молecular маркеров вес в кДа указаны. В. Динамические рассеяния света анализа одного и того же препарата диска. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Анализ MalFGK _2-nanodisc частиц. A. Гель сдвиг анализ мужской инкубировали с увеличением количества MalFGK _2-nanodisc частиц. B. АТФазы MalFGK _2-nanodisc частиц как функция мужчины концентрации.

Обсуждение

Мы опишем простую процедуру для разведения мальтоза транспортера в nanodiscs. Транспортер АТФазы активного и взаимодействия с растворимым обязательного партнера-мужчины могут быть воссозданы (рис. 3). Успешное восстановление транспортера в nanodiscs открыть путь для дополнительного ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Amicon Ультра-4 50K центробежный фильтр	Millipore	UFC805008	Следуйте протоколу производителя для надлежащего использования
Bio-Beads SM-2 Адсорбент	Bio-Rad	152-3920
E.coli, общих липидов	Avanti Polar Lipids	100500C	Растворяют в хлороформе, обращаться по мере необходимости для органического растворителя
Ni сефарозе HP смолы	GE Healthcare	17-5268-01
Решение фосфора стандартных	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Таблица I. Конкретные реагенты.
			Имя Состав Комментарии DDM складе 10% вес / объем DDM Ресуспендируют в MilliQ воду и хранят при -20 ° C MalFGK 2 акции 1-2 мг / мл 50 мМ Трис-HCl, pH7.9 100 мМ NaCl 10% объем / объем глицерина 0,03% вес / объем DDM Хранить при температуре от -70 ° C после очистки MSP складе 10-15 мг / мл 50 мМ Трис-HCl, pH7.9 100 мМ NaCl 10% объем / объем глицерина Хранить при температуре от -70 ° C после очистки в <1 мл аликвоты и избегать чрезмерного циклов замораживания / оттаивания Фосфолипидов складе 5 нМ E. палочка общих липидов 0,5% м / о (10 мМ) DDM 50 мМ Трис-HCl, рН 7,9 50 мМ NaCl Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 недели TS буфер 50 мМ Трис-HCl, рН 7,9 50 мМ NaCl Хранить при температуре 4 ° C TSG10 буфер 50 мМ Трис-HCl, pH7.9 100 мМ NaCl 10% объем / объем глицерина Хранить при температуре 4 ° C TSG20 буфер 50 мМ Трис-HCl, рН 8 100 мМ NaCl 20% объем / объем глицерина Хранить при температуре 4 ° C TSGD буфер 50 мМ Трис-HCl, pH7.9 100 мМ NaCl 10% объем / объем глицерина 0,03% вес / объем DDM Хранить при температуре 4 ° С и добавить DDM непосредственно перед употреблением Таблица II. Решение рецептов.