Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

Резюме

Недавние достижения в способности генетически манипулировать соматическими клеточными линиями имеют большой потенциал для фундаментальных и прикладных исследований. Здесь мы представляем два подхода для производства и скрининга генерируемых нокаутом CRISPR / Cas9 в клеточных линиях млекопитающих с использованием и без использования селективных маркеров.

Аннотация

Инженерная система генома CRISPR / Cas9 произвела революцию в области биологии, позволив без особого труда точно редактировать геном. Управляемый одной направляющей РНК (sgRNA), которая придает специфичность, белок Cas9 расщепляет обе линии ДНК в целевом локусе. Разрыв ДНК может вызывать либо не гомологичное концевое соединение (NHEJ), либо гомологичный направленный ремонт (HDR). NHEJ может вводить небольшие делеции или вставки, которые приводят к мутациям смены кадров, тогда как HDR допускает большие и более точные возмущения. Здесь мы представляем протоколы для генерации клеточных линий нокаута путем связывания установленных методов CRISPR / Cas9 с двумя вариантами выбора / скрининга ниже по течению. Подход NHEJ использует единый сайт расщепления sgRNA и независимый от отбора скрининг, где производство белка оценивается точным иммуноблотом с высокой пропускной способностью. В методе HDR используются два сайта, разрезающих sgRNA, которые охватывают интересующий ген. Вместе с предоставленным шаблоном HDR этот метод может обеспечить удалениеИз десятков kb, чему способствует вставленный селективный маркер сопротивления. Обсуждаются соответствующие приложения и преимущества каждого метода.

Введение

Стабильные генетические изменения обеспечивают преимущество перед переходными методами клеточного возмущения, которые могут быть переменными по эффективности и продолжительности. Геномное редактирование становится все более распространенным в последние годы из-за развития целевых специфических нуклеаз, таких как нуклеазы цинка-пальца ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , транскрипционные активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs) ^{6 , 7 , 8 , 9} И RNA-направленные нуклеазы, полученные из кластеризованной, регулярно интерполированной системы коротких палиндромных повторов (CRISPR) ¹⁰ .

Механизм редактирования CRISPR / Cas9 адаптирован из иммунной системы, которую используют бактерии и археи для защиты от вирусных инфекцийAss = "xref"> 11 ^{, 12 , 13} . В этом процессе короткие, 20-30 н.т. фрагменты инвазионной вирусной последовательности включены в геномный локус в виде «спейсеров», фланкированных повторяющимися звеньями ^{14 , 15} . Последующая транскрипция и обработка РНК генерируют небольшие CRISPR-ассоциированные РНК ¹⁶ (crRNAs), которые вместе с транс-активирующей кРНК ¹⁷ (tracrRNA) собираются с эффекторной эндонуклеазой Cas9. Таким образом, кРНК обладают специфичностью к таргетированию каз9, направляя комплекс для расщепления комплементарных последовательностей вирусных ДНК и предотвращения дальнейших инфекций ^{18 , 19} . Любая последовательность «protospacer» в целевой ДНК может служить источником crRNA, если она непосредственно 5 'к короткому протоспасферу, смежному мотиву (PAM), NGG в случае S. pyogenes Cas9 ^{20. Отсутствие последовательности PAM вблизи спейсера в локусе CRISPR хоста различает «я» и «не-я», предотвращая нацеливание хоста. Из-за своей универсальности и гибкости, эта биологическая система была сильно адаптирована для геномного редактирования, так что почти любой сайт, расположенный рядом с PAM, может быть нацелен. В этой версии дополнительная модификация сливала crRNA и tracrRNA в один направляющий РНК (sgRNA) компонент, который загружается в белок Cas9 21 .}

При экспрессии Cas9 и sgRNA в эукариотических клетках белок Cas9 расщепляет обе линии ДНК в целевом локусе. В отсутствие подходящей области гомологичной последовательности клетка фиксирует этот разрыв через не гомологичное концевое соединение (NHEJ) ^{22 , 23 , 24} , которое обычно вводит небольшие делеции или, реже, вставки. При таргетинге на открытыйРамка считывания, ремонт, вероятно, приводит к поступательному сдвигу кадров, который создает нефункциональный белковый продукт. Напротив, при наличии экзогенной матрицы с большими областями гомологии клетка может фиксировать разрыв двух нитей с помощью гомологичного направленного ремонта ^{25 , 26} . Этот маршрут допускает более крупные точные удаления, замены или вставки в геноме в сочетании с введением маркеров подакцизного выделения ²⁷ .

Здесь мы представляем протоколы для генерации клеточных линий нокаута одним из этих двух методов CRISPR / Cas9 ( рисунок 1A ). Подход NHEJ использует единый сайт расщепления sgRNA и независимый от отбора скрининг и, следовательно, требует небольшой предварительной подготовки. При использовании этого метода необходимо разработать направляющие РНК, дополняющие экзоны около 5'-конца транскрипта, которые, скорее всего, будут производить нокаут. Поскольку modificatИонов в этом геноме мало, скрининг на клоны для нокаутов основан на дот-блотах, где белковый продукт оценивается с высокой пропускной способностью. В качестве примера мы используем выработку линий выведения ELAV-like 1 (ELAVL1). Второй подход основан на восстановлении гомологии (HDR) и использует два сайта среза sgRNA, которые охватывают ген или область интереса, что позволяет удалять десятки килобайт. Плазмида с двумя регионами гомологии, которые расположены по участкам расщепления, обеспечивает шаблон замены ( фиг. 1B ), вводя селективный маркер сопротивления, который повышает эффективность генерации нокаута. Этот метод также может быть адаптирован для введения модификаций генов с правильно разработанными головками гомологии. В этом случае интеграция нового фрагмента ДНК позволяет проводить скрининг на основе ПЦР ( рис. 1С ). Здесь мы используем в качестве примера создание линий нокаута 2-го члена семейства Pumilio RNA (PUM2).

протокол

1. Идентификация областей гомологии вокруг желаемого удаления

ПРИМЕЧАНИЕ. Необходимо только при использовании редактирования на основе выбора.

1. Выберите две области, первоначально 1,5-2 kb, по обе стороны от желаемого локуса для удаления, которые будут служить в качестве гомологического оружия в шаблоне HDR ( рис. 1A ). Определите регионы, в которых отсутствуют сайты распознавания BsaI ни на одной из сторон (GGTCTC), чтобы облегчить клонирование. Если сайты BsaI неизбежны, используйте альтернативный рестрикционный фермент IIs (BsmBI, SapI, BbsI) и модифицируйте соответствующие сайты в реципиентной плазмиде (pUC19-BsaI), резистентную маркерную донорную плазмиду (pGolden-Neo или pGolden-Hygro) и Плечи продукта PCR с гомологией.

2. Генерация плазмид экспрессии каз9-sgРНК

1. Определите сайт (ы) для таргетинга для мутагенеза. Для метода однократной, без выбора, целевого 5 'проксимального кодирования экзонов для увеличения вероятности не-fuМутацией. Для метода двух разрезов выберите два сайта, которые по мере необходимости занимают столько же гена.
   ПРИМЕЧАНИЕ. По нашему опыту эффективно удаляются до 53 кб.
2. Введите 200-300 бит целевой последовательности областей в инструмент проектирования crispr.mit.edu. Для клонирования на основе выбора используйте 200-300 пар оснований идентифицированных областей гомологии, которые расположены ближе к локусу для удаления ( рисунок 1A ). Выберите 2-3 из наиболее ранжированных sgRNAs для каждого целевого региона, чтобы учесть различия в их активности, и изолировать независимые клоны, которые не имеют одинаковых потенциальных побочных эффектов.
3. Для создания дуплексных олигонуклеотидов с соответствующими выступами для введения в плазмиду экспрессии опустить конечную последовательность PAM (NGG) и добавить 5'-CACC-высадку, а затем G на олигонуклеотид верхней нити. Для олигонуклеотидов нижней нити добавьте 5'-AAAC навес к последовательности с обратной добавленной мишенью, за которой следует 3'-C, так как ilНиже:
   
4. Вставьте синтетические олигонуклеотиды, соответствующие sgRNAs в плазмиду pSpCas9 (BB) с использованием клонирования Golden Gate ^28, как описано в лабораторном протоколе Zhang ²⁹ .

3. Генерация гомологично-ориентированных шаблонов восстановления шаблонов

ПРИМЕЧАНИЕ. Необходимо только при использовании редактирования на основе выбора. Гомологически ориентированная восстанавливающая шаблонная плазмида состоит из кассеты с лекарственной устойчивостью, фланкированной двумя регионами, которые комплементарны геному, расположенному за пределами двух целевых сайтов sgRNA ( фиг. 1В ).

1. Из более широких областей гомологий, определенных на шаге 1.1, выберите 800-1000 bp ²⁶ не более чем на 5-10 б.п. от разработанных участков среза Cas9, чтобы служить в качестве оружия гомологии ( рис. 1A ). Не включайте sgRNAЦелевого сайта и его PAM в руках гомологии, поскольку это приведет к расщеплению CRISPR / Cas9 самой плазменной плазмы. Если в слоях гомологии имеются внутренние сайты BsaI, используйте альтернативные сайты sgRNA.
2. ПЦР усиливают руки гомологии из геномной ДНК с использованием высоконадежной ДНК-полимеразы в соответствии с инструкциями производителя, используя прямые и обратные праймеры с дополнительной 5'-последовательностью, которая вводит сайты BsaI (GGTCTC) и уникальные выступы на обоих концах области гомологии. Выступы должны содержать правильные последовательности для формирования правильного порядка сборки и ориентации, как описано ниже ( рисунок 1B ):
   Левая рука гомологии FP свеса: 5 'GGGTCTCA GGCC
   Левый гомологический рычаг RP свес: 5 'GGGTCTCT CACG
   Правый гомологический рычаг FP overhang: 5 'GGGTCTCA GTCC
   Правый гомологический рычаг RP свес: 5 'GGGTCTCT CCAC
3. Проверьте оружие гомологии для соответствующего амплифаС помощью гель-электрофореза перед продолжением вперед.
4. Соберите правую и левую области горизонтальной гомологии с помощью кассеты сопротивления в плазмиду шаблона HDR с помощью клонирования Golden Gate ²⁸ . Используйте плазмиды pGolden-Neo или pGolden-Hygro ³⁰ в качестве источника кассет сопротивления loxP-фланкированных (loxP-PGK-Neo-pA-loxP или loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Используйте pUC19-BsaI, модифицированный pUC19 с сайтами BsaI в области множественного клонирования и удалил сайты BsaI в другом месте, в качестве вектора-получателя (доступно по запросу). Используйте соотношение 1: 1: 1: 1 для трех вставок и вектора.
   1. Подготовьте следующую реакционную смесь ³⁰ :

      Правый гомологический рука PCR-продукт	0,06 пмоль (30-40 нг)
      Левый гомологический рука PCR-продукт	0,06 пмоль (30-40 нг)
      Плазмида pGolden-Neo (100 нг / мкл)	1 &# 181; L
      Плазмиду pUC19-BsaI (100 нг / мкл)	1 мкл
      2x T7 ДНК-лигазный буфер	5 мкл
      BsaI (10 U / мкл)	0,75 мкл
      ДНК-лигазу T7 (3000 U / мкл)	0,25 мкл
      вода	До 10 мкл

   2. Используйте следующие параметры термоциклера: 37 ° С в течение 5 мин, 20 ° С в течение 5 мин. Повторите операцию на 30 циклов.
   3. Обработайте клонирующий продукт экзонуклеазой по инструкциям производителя, чтобы переварить оставшуюся линеаризованную ДНК.
   4. Превращают реакционную смесь в компетентный штамм E.coli в соответствии с протоколом, поставляемым с клетками, и планшет на ампициллинсодержащих чашках.
5. Чтобы идентифицировать клоны с помощью правильной сборки шаблона, выполнитеЧтобы амплифицировать подошвы подгонки гомологии собранной вставки (поскольку вся вставка может быть слишком большой для надежного усиления). Используйте один отжиг праймера к фланкирующей последовательности плазмиды и второй праймер, дополняющий кромку кассеты с сопротивлением ( фиг. 1В , эта последовательность является общей как для вкладышей Neo, так и Hygro), генерируя зависимый от сборки продукт, который приблизительно на 200 б.п. больше, чем Содержащаяся гомология:
   PUC19-Bsal-Left: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
   Сопротивление слева: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
   PUC19-BsaI-Right: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
   Сопротивление справа: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
   1. Выбирайте колонии бактерий со стерильными зубочистками и суспендируйте бактерии в 20 мкл воды. Нагреть при 95 ° С в течение 15 мин и открутить в столешнице центрифугу при максимальной скорости в течение 5 мин. Поместите сразу на лед.
   2. Подготовьте следующую смесь ПЦР ^{31 <}/ SUP>:

      Развернуть шаблон колонии	1,25 мкл
      10x реакционный буфер Taq	1,25 мкл
      20 мМ dNTP	0,25 мкл
      10 мкМ Прямой праймер	0,25 мкл
      10 мкМ Обратный праймер	0,25 мкл
      Taq-полимераза	0,25 мкл
      вода	9 мкл

   3. Используйте следующие параметры термоциклера: 95 ° C в течение 30 с (95 ° C 30 с, 61 ° C в течение 30 с, 72 ° C в течение 1 мин / кб), повторите в течение 25 циклов, 72 ° C в течение 2 мин.
   4. Проверьте продукт ПЦР на правильный размер ампликона с помощью электрофореза в агарозном геле.
   5. По желанию, минипреп-плазмидная ДНК из отдельных колоний с правильными размерами вставки и последовательностьюE гомологичных областей секреции Sanger с упомянутыми выше усилительными праймерами.

4. Трансфекция компонентов CRISPR в культивируемые клетки

1. До трансфекции: клетки культуры T-REx293 в среде DMEM, дополненные 10% FBS при 37 ° C и 5% CO ₂ .
2. Плиты клеток на 6-луночные планшеты и растут примерно до 70% слияния. Включите колодец для нетрансфекционного контроля.
3. Трансфектные клетки с общей плазмидой 2,5 мкг с использованием протокола коммерческой трансфекции. Параллельно поддерживайте нетрансфицированный контроль.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Метод трансфекции и эффективность варьируются в зависимости от типа ячейки. Определите подходящий метод трансфекции для системы перед экспериментом.
   1. Для трансфекции клеток с селекцией используйте 0,75 мкг Cas9-sgRNA 1 (левый срез), 0,75 мкг Cas9-sgRNA 2 (правый разрез) и образец гомологичной рекомбинации 1,0 мкг.
   2. Для трансфекцииНа клетках без отбора, используйте 2,5 мкг плазмиды Cas9-sgRNA.

5. Выбор лекарств

1. Через 48 ч после трансфекции обрабатывают клетки соответствующим препаратом (неомицин / гигромицин). Выполните выбор до тех пор, пока все клетки в нетрансфицированном контрольном штампе (обычно 3-5 дней для Нео, 7-14 дней для Hygro).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте концентрации 500 мкг / мл и 10 мкг / мл для неомицина и гигромицина соответственно для клеток T-REx293. Для других типов клеток может быть полезно провести предварительное титрование лекарственного средства на нетрансфицированных клетках для определения эффективной концентрации.

6. Изоляция клональных групп населения

1. Выращивайте клетки до 100% слияния в исходном колоде после отбора. Высевают клетки в 96-луночные планшеты с плотностью 0,33 клеток на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Поселение трех 96-луночных планшетов является хорошей отправной точкой для обеспечения изоляции более чем одного правильного клона, но может потребоваться более или менееЗаканчивая эффективностью sgRNA и HDR.
2. Наблюдайте за колониями в течение 2-4 недель, пока колонии не будут видны глазу. Выбирайте видимые колонии со стерильным наконечником пипетки и подавайте в новые лунки, чтобы стимулировать рост монослоев. При использовании суспензионных клеток даже более низкая плотность посева может быть использована для обеспечения большей доли колоний с колониями.

7. Кандидаты на скрининг

1. Отбор кандидатов без использования выбора: дот-блот
   1. Растут отдельные клоны до 50-100% слияния. Выдвиньте монослой клеток путем пипетирования внутри колодца.
   2. Аликвоту 90 мкл общего объема 100 мкл в чистую микроцентрифужную пробирку. Скручивают при 6000 об / мин в течение 5 мин, удаляют среду и осаждают лизис клеток в 10 мкл 1x буфера для лизиса или 1x буфера для загрузки SDS (5x: 250 мМ Tris-Cl, pH 6,8, 8% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 40% Глицерин, 100 мМ DTT). Добавьте 90 мкл новых носителей в оставшуюся часть клеток вL продолжить распространение.
   3. Внесите 1 мкл клеточного лизата на сухую нитроцеллюлозную мембрану, чтобы сформировать точку. Промойте каждый образец дважды на две отдельные мембраны, создавая две идентичные образцы образцов.
   4. Блокировать мембраны в 5% молоке в TBST (Трис-буферный солевой раствор + 0,01% Твин 20: 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 3 г Трис-основания, до 1 л дистиллированной воды, pH 7,4) ^{31 в} течение 1 часа при комнатной температуре ( С качанием, здесь и на протяжении всей процедуры).
   5. Блот с использованием первичного антитела против целевого белка на одной мембране и первичное антитело для контрольного белка (тубулин, GAPDH или любой другой белок, который, как ожидается, не изменится), с другой. Используйте рекомендуемое первичное разведение антител (0,2 мкг / мл для ELAVL1 и 0,1 мкг / мл для Pum2 в этом случае) в TBST + 5% молока. Инкубируйте 1 ч при комнатной температуре.
   6. Промыть 3 раза TBST в течение 5 мин.
   7. Инкубируйте каждую мембрану с соответствующим HRP-конъюгированным вторичным антителом в TBST + 5% молока в течение 1 часа при комнатной температуре.
   8. Промыть 3 раза TBST в течение 5 мин.
   9. Примените раствор хемилюминесцентного субстрата (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя и изобразите сфотографированную мембрану на цифровом хемилюминесцентном изображении.
   10. Определите количественные значения интенсивностей точек для целевого и контрольного белков с использованием соответствующего программного обеспечения.
   11. Исключить кандидатов с низким сигналом контрольного белка и рассчитать фоновые вычитаемые отношения мишени для контроля интенсивности белка для остальных кандидатов. Выберите кандидатов с самыми низкими коэффициентами для прохода и дальнейшей проверки с помощью вестерн-блоттинга.
2. Скрининг кандидатов с использованием селекции: колония PCR
   1. Собирайте лизат клеток с помощью набора для подготовки ДНК (см. Таблицу материалов ).
      1. Дублируйте отдельные колонии в новом 96-луночном колоде и произрастайте до 100% слияния.
      2. Удалите носитель из одного набора клонов,N ресуспендируют клетки в 30 мкл экстракционного буфера из набора. Перенесите в чистую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку.
      3. Нагреть раствор до 96 ° С в течение 15 мин и дать охладиться до комнатной температуры.
      4. Добавьте 30 мкл стабилизирующего буфера из набора. Хорошо перемешать.
   2. Определите дикого типа и моноаллельные / биаллельные мутантные линии методом колонии PCR.
      1. Разработайте два отдельных набора ПЦР-праймеров (для левой и правой стороны целевого локуса), чтобы усилить области вокруг рук гомологии на основе успешной или неудачной интеграции резистивной кассеты ( рисунок 2C ). С каждой стороны используйте общий праймер (красный), который отжигает вне руки гомологии. Используйте его с соответствующим парным праймером, который дополняет эндогенную последовательность, охватывая область гомологии (синий), для проверки аллеля дикого типа. Используйте другой парный праймер, дополняющий вставленную резистентную кассету (см. Праймеры в разделе2.3), чтобы проверить желаемую мутацию.
      2. (Рекомендуется) Проверьте набор праймеров с использованием клеточного лизата из исходной выбранной популяции массивных клеток, так как он будет содержать смесь как WT, так и мутантных аллелей ( рисунок 2D ).
      3. Подготовьте следующую реакционную смесь:

         Клеточный лизат	0,5 мкл
         Буфер 10x KOD	1,25 мкл
         25 мМ MgSO4	0,75 мкл
         2 мМ dNTP	1,25 мкл
         10 мкМ Прямой праймер	0,375 мкл
         10 мкМ Обратный праймер	0,375 мкл
         Полимераза KOD	0,25 мкл
         вода	7,75 мкл

      4. Используйте следующие условия термоциклов: 95 ° C в течение 2 минут (95 ° C в течение 20 с, Primer Tm в течение 10 с, 70 ° C в течение 20 с / кб) повторите в течение 25 циклов.
      5. Визуализируйте продукт ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле.
   3. Повторите тестирование ПЦР колонии для каждой стороны прогнозируемой интеграции. Выбирайте и расширяйте кандидатов, которые показывают наличие интеграции и отсутствие продукта эндогенной последовательности для удаленной области.
   4. Подтвердите позитивные кандидаты вестерн-блот и / или RT-qPCR.

8. Проверьте геномную мутацию путем секвенирования

1. Выделение геномной ДНК из мутантных клеточных линий путем экстракции фенольным хлороформом ³¹ .
2. ПЦР амплифицируют целевую область sgRNA, используя праймеры с 5'-выступами, которые добавляют сайты рестрикции BsaI к каждому концу.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для клонов, отредактированных с помощью HDR, где оба аллеля могут быть идентичными, продукт ПЦР можно секвенировать напрямую,
3. Клонировать амплифицированную область в pUC19-BsaI путем клонирования Golden Gate.
4. Превратите реакционную смесь в компетентный штамм E.coli .
5. ДНК плазмиды Miniprep из 6-10 отдельных колоний и последовательность клонированной области с помощью секвенирования Сангера.

Результаты

Для генерации линий нокаута ELAVL1 было доступно надежное антитело, поэтому было выполнено редактирование с использованием одиночных sgRNAs ( рис. 1A , слева), а затем точечный иммуноблот. Три sgRNAs трансфицировали независимо, чтобы сравнить эффективность и иск...

Обсуждение

Система CRISPR / Cas9 позволила обеспечить эффективную генерацию стабильных геномных модификаций, которые обеспечивают более последовательную альтернативу другим способам временного манипулирования. Здесь мы представили два метода быстрой идентификации нокаутов гена CRISPR / Cas9 в клеточны...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Competent E. coli cells
plasmid prep kit
pSpCas9(BB) plasmid	Addgene	42230	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzyme	ThermoFisher	FD1014	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase	NEB	M0318L	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer	ThermoFisher	BY5	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease	Epicentre	E3105K	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase	NEB	M0494A	HA amplification
pUC19-BsaI			Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion
pGolden-Neo	Addgene	51422	Resistance cassette
pGolden-Hygro	Addgene	51423	Resistance cassette
BsaI enzyme	NEB	R3535S	Homology arm contruction
T7 DNA ligase	NEB	M0318L
PlasmidSafe exonuclease	Epicentre	E3105K
Toothpicks			bacterial PCR
Taq polymerase			bacterial colony PCR
HEK293 human cells
DMEM	Corning	10-013-CV
FBS	Corning	MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.)	Gibco	15140-122
6 well plates	BioLite	12556004
TransIT-LTI Transfection Reagent	Mirus	MIR2300	for lipofection only
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062	for lipofection only
G418 (Neomycin)	Sigma Aldrich	A1720-5G
Hygromycin	Sigma Aldrich	H3274-250MG
96 well plates	ThermoFisher	12556008
Passive Lysis Buffer, 5x	Promega
1x SDS loading buffer			recipe decribed in protocol
Nitrocellulose Membrane	Bio-Rad	162-0115
TBST			recipe decribed in protocol
Dehydrated milk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	ThermoFisher	34075	for HRP-conjugated secondary antibodies
Extracta DNA prep for PCR	Quantabio	95091-025
KOD polymerase	Novagen	71316