АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь описан простой и хорошо проверенных протокол для измерения активности сыпучих autophagic поглощения в mammalian клетках. Метод основан на количественной оценки доли Лактатдегидрогеназа (LDH) в sedimentable клеток фракций по сравнению с общей сотовой уровня ЛДГ.

Аннотация

Основная autophagy характеризуется поглощение значительная часть цитоплазмы в двойной/multi-membrane структуры, называют autophagosomes. Здесь описан простой протокол для контролировать этот процесс. Кроме того предоставляются типичные результаты и экспериментальной проверки метода autophagy склонение в условиях различных видов культивируемых клеток млекопитающих. Во время массовых autophagy autophagosomes секвестрировать в цитозоле и таким образом также растворимые цитозольной белков, наряду с другими autophagic груза. LDH является стабильной и очень обильные, растворимые цитозольной фермента, который неизбирательно поглощенных в autophagosomes. Таким образом, количество ЛДГ поглощение отражает количество массовых autophagic поглощения. Эффективно и точно определить уровень ЛДГ поглощения в клетках, мы используем протокол на основе electrodisruption фракционирования, который эффективно отделяет sedimentable от цитозольной ЛДГ, следуют измерения ферментативной активности в sedimentable фракции против поклеточного образцы. Autophagic поглощение определяется путем вычитания доли sedimentable ЛДГ в необработанной клеток из что в обработанных клеток. Преимущество пробирного поглощение ЛДГ, что это дает количественную меру autophagic поглощения эндогенного грузов, в отличие от других методов либо привлекать внематочная выражение связывания зондов или полуколичественного протеазы анализ защиты autophagy маркеры или рецепторов.

Введение

Autophagy (по-гречески «самостоятельной питания») является эволюционным процессом сохранены для вакуолярной/лизосомальных деградации внутриклеточных материала. После обнаружения связанных с autophagy («ГПТ») генов, которые являются важными для autophagy дрожжей и людей, и реализации что autophagy играет значительную роль в здоровье и болезни (подтверждено 2016 Нобелевской премии в области медицины или физиологии, чтобы Ёсинори Ohsumi), autophagy быстро стал одним из наиболее интенсивно изучаемых процессов в ячейки биологии1,2.

Macroautophagy (в дальнейшем именуемый «autophagy») характеризуется расширением и складной из межклеточная внутриклеточные мембраны («phagophores») в запечатанных, двойной или multi membrane структуры («autophagosomes»), которые эффективно поглощать enwrapped материал от остальной части цитоплазме. После слияния autophagosomes с лизосомы внутренний autophagosomal мембраны и поглощенных груз деградации и переработанных. Autophagosomes может поглощать цитоплазматических материал в случайных (неизбирательной autophagy) и манеры селективный (селективный autophagy). Основная autophagy скорее представляет собой смесь неизбирательной и селективного autophagy.

В 1960-х и 70-х годов («морфологические эра» autophagy исследований) autophagic поглощение оценивалось главным образом через ультраструктурных анализы. В 1980-х и начале 1990-х годов («биохимических эра») в Seglen и коллегами — кто изучал autophagy в первичной крыса гепатоцитов — разработал первый методы количественно измерить autophagic поглощение деятельности3. С помощью этих анализов, Seglen определены и охарактеризовал различные шаги autophagic лизосомальных пути4,5, обнаружил и придумал amphisome6 (продукт синтеза endosome-autophagosome) и был первым Опишите роль фосфорилирование белков в autophagy регулирование7. Однако, после обнаружения АТГС в 1990-х годов («молекулярная эра») и первая характеристика млекопитающих ATG8 белка, микротрубочки связанные белком 1A/1B-свет цепь 3 (LC3) в 2000 году8, использование ГПТ белков в качестве маркеров для autophagic процесс быстро завоевал популярность, и старше и более трудоемкий биохимические методы были выйдены позади. В самом деле, за последние 18 лет, Западная помарка и анализ микроскопии флуоресцирования LC3 стали на сегодняшний день наиболее популярные (и во многих случаях единственным) средства изучения autophagy в клетках млекопитающих. Преимуществом является относительная простота, в которой может осуществляться эти методы. Недостатком является то, что один учится корзину компонент (LC3) вместо фактических autophagic грузов. Это довольно серьезный недостаток, потому что отношения между государствами и/или потока LC3 через путь против поглощения и потока грузов весьма неясным. В самом деле, мы показали, что потока сыпучих грузов может поддерживаться на высоком уровне в условиях там, где нет LC3 потока, несмотря на присутствие конъюгированных LC3 в клетки9. Кроме того мы показали, что основная autophagy не зависит от эффективной LC3 истощения и таким образом вероятно LC3-независимые9. Этот вывод был позднее подтвержден LC3 исследования нокаут-10,11, которые также указывают, что Паркин зависимой mitophagy (селективный autophagy митохондрий) является независимым от LC310,11 .

Таким образом, существует явная необходимость грузов на основе анализов для мониторинга autophagic активности. Оптимально такие анализы должны быть широко применимы, четкие и легко выполнять. За последние несколько лет мы имели особый интерес в assay поглощение ЛДГ, который был разработан в Seglen в 1980-х12и основан на измерении передачи цитозольной ЛДГ sedimentable, autophagic вакуоль содержащих клеток фракции. LDH является стабильной, растворимые цитозольной белок, который легко совместно поглощенных при phagophores завертывать цитоплазматических грузов. Поглощение ЛДГ поэтому является мерой общего autophagic поглощения. LDH исключительно деградации autophagic лизосомальных пути12. Таким образом, в присутствии ингибиторов лизосомальных деградации, например, bafilomycin A1 (Baf)13, экспериментальное лечение эффекты непосредственно отражают изменения в деятельности autophagic поглощения. В отсутствие деградации ингибиторы чистый эффект изменений в ЛДГ поглощение и деградация может быть измерена.

Assay поглощение ЛДГ широко применимым, поскольку ЛДГ выражается высоко и повсеместно, во всех типах клеток, и ЛДГ уровни могут быть точно количественно ферментативные пробирного14,15. Однако, оригинал протокола12 — в первичной крыса гепатоцитов — довольно много времени и требует большого количества начиная материала, а также по индивидуальному заказу электрического разряда конденсатора. На основе поэтапного мы постепенно превратили assay в легкий и универсальный метод. Во-первых оригинальный протокол был адаптирован для использования в mammalian клетки линии16. Во-вторых метод был значительно уменьшенным разрешением3,9. В-третьих, несколько шагов в протоколе были ликвидированы, включая трудоемкий плотность подушке шаг17. Это одновременно позволило еще больше разукрупнение метода, от оригинального отправной точкой использованием плита 10 см за образец16 один колодец от 12-ну пластины на сэмпл (то есть, около 15 раз меньше начиная материал)17. В-четвертых мы определили коммерческий электропорации аппарат, который может заменить на заказ электрическим разрядом конденсатора17.

Здесь представлены наши самые современные протокол assay поглощение ЛДГ, который включает в себя некоторые дальнейшего упрощения метода по сравнению с ранее опубликованной17 . Кроме того показан набор типичных результаты, полученные в ряде различных типов клеток, и главное, предоставляются несколько строк экспериментальной проверки метода с использованием фармакологических, а также генетические сногсшибательно и нокаут подходы. Общая схема всего протокола см. Рисунок 1.

протокол

1. клетки посева и лечение

  1. Культура адэрентных клеток в колбах культуры ткани2 75 см в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C, с использованием предпочтительного питательной среды для типа ячейки в вопросе. Позволяют клеткам расти до тех пор, пока они достигают слоя клеток вблизи притока.
    Примечание: Используйте RPMI 1640 среднего дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) для LNCaP, HEK293, мышь эмбриональных фибробластов (MEFs), BJ, MCF-7 и клетки ПЭС-1.
    1. Вымойте клетки с рН 7,4 3 мл 37 ° C фосфат амортизированное saline (PBS). Заменить PBS с 3 мл 0,25% (w/v) трипсина тетранатрия (ЭДТА) и инкубировать колбу в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C, пока клетки (2-5 мин).
    2. Ресуспензируйте отдельные клетки с 7 мл питательной среды, содержащие 10% FBS. Смешайте 10 мкл клеток подвеска Алиготе с 10 мкл 0,4% Трипановый синий в пробки microcentrifuge, с помощью кончика пипетки 0,5 – 20 мкл. Использовать же наконечник пипетки, чтобы немедленно заполнить Счетной палаты слайд и подсчитать количество ячеек в счетчик автоматизированной клеток.
  2. Подготовить подходящий разрежения (см. Примечание ниже) суспензии клеток от шаг 1.1.2 использование культуры средний, содержащие 10% FBS и семян 1 мл суспензии разреженных клеток в каждой скважине пластины (площадь поверхности ~3.8 см2) 12-ну тканевые культуры с помощью асептического техника. Позволяют роста в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C, пока не будет достигнуто желаемого клеток плотность, например, 60-90% слияния в момент сбора урожая.
    Примечание: Соответствующие разбавления суспензии клеток, которые дадут нужной ячейки confluency в момент сбора урожая будет отличаться от типа ячейки, тип клеток, а также зависимости от продолжительности и типа экспериментальное лечение. Таким образом это должно эмпирически оцениваться в каждом конкретном случае.
    1. Для экспериментов, которые должны быть как лечить и собирают 2 дней после посева, семян 2,5 x 105 LNCaP, HEK293, или MCF-7 клетки, MEFs4 5 x 10, 4 x 105 BJ или 1,5 x 105 ПЭС-1 клеток в каждой скважине 12-ну пластины.
    2. Для клеток, которые придерживаются слабо пальто плит с типом покрытия, рекомендуется для типа ячейки в вопросе. Для LNCaP (и HEK293) клетки используют пластины, покрытые поли D-Лизин (PDL).
    3. Для этого добавьте 500 мкл PDL в 2,5 мкг/мл в стерильных H2O для каждой скважины, и инкубировать и пластины в стерильных условиях на 30 минут при комнатной температуре (20-25 ° C). Удаление PDL с всасывания и мыть каждый хорошо кратко с 1 мл стерильного H2O.
      Примечание: Как правило, шаг 1.2.1 делается без каких-либо экспериментальное лечение. Однако если интерференции, это может быть удобно начать обратный трансфекции с посевной9.
  3. Выполните экспериментальные методы лечения в двойные или тройные скважин в состояние.
    1. Например, обработать клетки с 50 Нм Torin1 МТОР ингибитор, который обычно является эффективным индуктором autophagic поглощения, или подвергать острого голода сыворотки - и аминокислоты клетки путем промывания клетки с 1 мл раствора свободных аминокислот Эрл сбалансированный Соли раствора (EBSS) среднего и впоследствии инкубации клеток в 1 мл EBSS в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C.
    2. Оставьте один набор лечить для того чтобы определить фоновый уровень ЛДГ sedimentable скважин.
    3. Добавьте насыщения количество после поглощения ингибиторы bafilomycin A1 (Baf)3,13,,1618 в отсутствие или наличие экспериментальное лечение, 3-4 ч до ячейки урожай. Инкубировать клетки в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C.
      1. Использование 100 Нм КБА для LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 и клетки ПЭС-1 и 10 Нм КБА для MEFs.
      2. Экспериментальные методы лечения, которые имеют продолжительность только 3-4 ч (как обычно имеют те свидетельствует в шаг 1.3.1), добавить Baf одновременно с лечения. Для более экспериментальное лечение ждать до 3-4 ч до сбора урожая и добавить 2 мкл 500 x сосредоточены Baf фондовой непосредственно в среду.
      3. Смешать, агитируя пластину сразу же после добавления Baf. На данный момент это также рекомендуется, чтобы добавить macroautophagic поглощения ингибиторы как элементы управления, например, 10 мм Пан phosphoinositide 3-киназы ингибитора (PI3K) 3-метил аденин (3MA)19или 10 мкм селективного PI3K класса III ингибитор САР-405-20.

2. ячейка урожай и подготовка к Electrodisruption

  1. В конце периода лечения аспирационная средних с всасывания и добавить 200 мкл клеток отряд решение (предварительно нагревают до 37 ° C) в каждой скважине. Инкубируйте при 37 ° C, пока клетки (обычно около 5 мин).
    Примечание: 0,25% (w/v) трипсина-ЭДТА может использоваться вместо решения отряд клеток, в то время как последний содержит DNase, который помогает уменьшить вязкость отдельных клеток. До тех пор, как носитель тщательно наддува, это не надо мыть ячейки перед добавлением решения отряд трипсина-ЭДТА или ячейки.
  2. Добавьте 500 мкл PBS комнатной температуре (20-25 ° C), рН 7,4, содержащий 2% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) для каждой скважины и Ресуспензируйте с пипеткой, до тех пор, пока не скопления клеток являются видимыми. Немедленно перевести суспензию клеток в 1,5 мл microcentrifuge трубы на льду.
    Примечание: Если не указано иное, выполняют все последующие шаги на льду.
  3. Отложения клетки центрифугированием при 400 x g 5 мин при 4 ° C.
  4. Тщательно удалить супернатант (с всасывания) покинуть ячейку гранулы как можно более сухой.
  5. Добавьте 400 мкл 10% (w/v) сахарозы (в сверхчистого H2O) к каждой трубе.

3. плазматической мембраны Electrodisruption и разделение клеток Sedimentable и общей фракций

  1. Ресуспензируйте клетки лепешка с пипеткой получить вблизи подвеска одноклеточных и передача его в кювет электропорации 4 мм.
    Примечание: Дозирование прихваченного ~ 10-15 раз, используя кончик пипетки 100-1000 мкл, обычно достаточно.
  2. Поместите кювету в экспоненциальный распад electroporator волны и выполнять один электрического импульса на 800 V, 25 МКФ и 400 Ω; Эти параметры производят пульс продолжительностью ~ 8 мс.
  3. Использовать новый наконечник пипетки для передачи disruptate клеток на трубу microcentrifuge 1,5 мл, содержащих 400 мкл ледяной фосфат амортизированное сахарозы решение (монофосфат натрия 100 мм, 2 мм Дитиотреитол (DTT), 2 мм ЭДТА и 1,75% сахарозы, рН 7,5) и перемешать кратко дозирование.
    1. Необязательно: Чтобы проверить эффективного плазматической мембраны electrodisruption17, смешать 10 мкл разбавленного клеток disruptate из шага 3.3 с 10 мкл 0,4% Трипановый синий в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Передача в Счетной палате и убедитесь, что процент положительных клеток Трипановый синий > 99%.
      1. Оставьте образец в Счетной палате за 30 мин при комнатной температуре (20-25 ° C) и убедитесь, что доля Трипановый синий позитивных клеток оставалась > 99%.
    2. Необязательно: Чтобы проверить, что electrodisruption не были слишком жесткими, то есть, он не нарушил внутриклеточных органелл, выполните шаги 1.1-3.3, как описано выше, но использовать больше исходного материала (ну от 6-ну пластины с слоем вырожденная клеток ~ 80%), и использовать 150 мкл 10% сахарозы в шаг 2,5 и 150 мкл раствора сахарозы, фосфат амортизированное без DTT в шаге 3.3.
      1. Использование пипетки для тщательно слой 200 мкл разбавленного клеток disruptate решения поверх подушки плотностью 1,2 мл фосфат амортизированное 8% (w/v) плотность градиента среды (например, 8% Nycodenz, 50 мм натрия фосфат, 2,2%-ая сахароза, 1 мм ЭДТА) в центрифугу 2 мл трубка. Центрифуга на 20000 x g 45 мин при температуре 4 ° C в microcentrifuge с мягкой-режим (для мягкое ускорение и замедление) и тщательно положить трубы на льду.
      2. Осторожно удалите 60 мкл ~ 200 мкл Топ фракции, не забудьте подобрать любое решение средний градиент плотности и передать свежие microcentrifuge трубки.
        Примечание: Это должно содержать цитозоль исключительной чистоты, называют «ячейки sap»21.
      3. Тест на чистоту фракции полученные на предыдущем шаге, выполняя Вестерн-блот анализ органеллы содержатся белки, с использованием стандартных методов и 4 – 20% градиента гели16.
      4. Например выполните immunoblotting катепсин B21, цитохром с, и глюкозоизомеразная дисульфида белка, чтобы убедиться, что электрическим током на шаге 3.2 не нарушил лизосомы, митохондрии или эндоплазматического ретикулума, соответственно, immunoblot для ЛДГ для проверки наличия цитозольной белка в ячейке sap.
      5. Параллельно выполняют immunoblotting на белок выдержки из решения disruptate ячейке16 для подтверждения, что антитела, которые используются может обнаружить органеллы содержатся белки, которые оцениваются.
  4. Повторите шаги 3.1 – 3.3 для каждого образца.
  5. Удаление 550 мкл из каждого решения disruptate разбавленным клеток (полученное на шаге 3.3) 2 мл microcentrifuge пробирки, содержащие 900 мкл ледяной ресуспендирования буфера (монофосфат натрия 50 мм, 1 мм DTT, 1 мм ЭДТА и 5,9% сахарозы, pH 7.5) дополнена 0,5% BSA и 0,01% Tween-20 и перемешать кратко, закупорить.
  6. Центрифуга на 18,000 x g 45 мин при температуре 4 ° C для производства гранулы, содержащие «осажденный ЛДГ». Тщательно удалить супернатант (с всасывания) оставить гранулы как можно более сухой. Поместите образцы в морозильной камере-80 ° С.
  7. Передать новые трубы 150 мкл от каждого решения disruptate разбавленным клеток (полученных на шагу 3.3) и место образцы в морозильной камере-80 ° С. Используйте эти образцы для определения уровней «всего ЛДГ» в клетках.
    Примечание: На данном этапе эксперимента может быть приостановлена для до тех пор, как хотелось.

4. ЛДГ добыча и измерение ферментативной активности ЛДГ

  1. Оттепель «Отложившейся ЛДГ» (из шага 3.6) и «всего ЛДГ» образцы (из шага 3.7) на льду.
  2. Добавьте 300 мкл ледяной ресуспендирования буфера, содержащего 1,5% Тритон X-405 для «Всего ЛДГ» образцы (уступая окончательный Тритон X-405 концентрации 1%). Вращайте пробы на ролик в холодной комнате (4 – 8 ° C) за 30 мин.
  3. 750 мкл буфера ледяной ресуспендирования с 1% тритон X-405 к «Осажденный ЛДГ» образцы и Ресуспензируйте окатышей с пипеткой, пока не будет достигнуто однородный раствор.
  4. Центрифугуйте образцы из шага 4.2 и 4.3 на 18,000 x g 5 минут при температуре 4 ° C для отложения сжимающих сотовой мусора.
  5. Смешайте 4 части холодного 65 мм имидазола (рН 7.5)/0.75 мм пирувата с одной частью имидазола холодной 65 мм (рН 7,5) / 1,8 мм NADH для получения рабочей решение, которое является стабильным, по крайней мере три недели при 4 ° C.
  6. Смешайте 3 – 30 мкл supernatants из шага 4.4 с 200 мкл рабочего раствора шаг 4.5.
  7. Определить количество ЛДГ, измеряя ферментативную активность ЛДГ как снижение Никотинамидадениндинуклеотид (в сокращенной форме) (NADH) поглощения на 340 Нм при 37 ° C по сравнению с Стандартный с известной концентрацией ЛДГ. Выполнение измерений оптической плотности до тех пор, пока Реакция подошел завершения, т.е. до поглощения на 340 Нм больше не меняется со временем.
    Примечание: Это классический биохимический метод для измерения активности ЛДГ. Хотя текущий протокол выполняет реакции при 37 ° C, она может также выполняться при комнатной температуре (20-25 ° C), который является желательным, если делать вручную спектрофотометрии. Текущий протокол использует роботов multianalyzer инструмент, который в автоматическом режиме смеси образцы с рабочего раствора в 96-луночных тарелку и меры поглощения на 340 Нм при 37 ° C каждые 20 s на 3 мин. После этого, инструмент программное обеспечение вычисляет концентрацию ЛДГ, выраженные в единицах (U) / L, сравнивая склона измерения оптической плотности с течением времени, по сравнению с калибровочной кривой получены путем калибровки с стандартом известных ЛДГ концентрация. Линейная дальность обнаружения, этот подход является 30 – 1.500 U/л. В качестве альтернативы существует широкий спектр коммерчески доступные наборы для определения ЛДГ. Некоторые из них основаны на муфты ферментативные реакции на поколение продуктов колориметрического или флуоресцентные, Включение обнаружения другими средствами, чем УФ-спектрофотометрии и с других линейных рядов обнаружения.

5. Расчет поглощения ЛДГ

  1. Рассчитайте процент отложившейся ЛДГ в целом ЛДГ для каждого образца, принимая разведений и выборки во внимание:
    Осажденный ЛДГ (%) =figure-protocol-13330
    Примечание: Во время действия 3.1 – 3.3 приблизительно 50 мкл теряется из-за передачи в и из кювета электропорации. Таким образом Вычислите из в общей сложности 750 мкл (вместо 800 мкл) из разбавленных ячейки disruptate в шаге 3.3.
  2. Вычесть процент отложившейся ЛДГ, полученные в образцах из необработанной клеток (шаг 1.3.2) от процент отложившейся ЛДГ, полученные в пробах экспериментально обработанные клетки и разделить время лечения с Baf получить процент поглощенный ЛДГ в час в период выборки:
    Поглощенный ЛДГ (% / ч) =figure-protocol-13937

Результаты

С помощью протокола описанных здесь, основная autophagic поглощение активности в ряде различных млекопитающих клеточных линий, включая LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, мышь эмбриональных фибробластов (MEFs), ПЭС-1, HEK293, BJ и LNCaP клетки была измерена. Поглощение оцен...

Обсуждение

В резюме протокол, описанные здесь представляет собой надежный и широко применяется метод для мониторинга активности сыпучих autophagic поглощения в mammalian клетках. По сравнению с оригинальной метод12,16, мы удалены несколько лишних шагов, упрощенный несколько ...

Раскрытие информации

Авторы имеют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была финансовую поддержку научно-исследовательский совет Норвегии, в Университете Осло, фонда Anders Jahre, Фонд Нансена и наследие в памяти Хенрик Homan. Мы благодарим д-р Нобору Mizushima для ATG5 +/ + MEFs и ATG5-/-MEFs, доктор Масааки Komatsu для ATG7 +/ + MEFs и ATG7/MEFs и доктор Сидзуо Akira для ATG9A +/ + MEFs и ATG9A/MEFs. Мы благодарим Фрэнк Sætre для оказания технической помощи и д-р за Seglen O. для конструктивного обсуждения методологических.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes Eppendorf211-2130 and 211-2120
12-well plates Falcon353043
Accumax  cell detachment solutionInnovative Cell TechnologiesA7089Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1EnzoBML-CM110-0100Dissolve in DMSO
BJ cellsATCCCRL-2522use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA)VWR422361V
Burker counting chamberFisher Scientific139-658585
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermoFisher ScientficC10228
Countess II Automated Cell CounterThermoFisher ScientficAMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamberFisher Scientific139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) Bio-Rad3450034
DTTSigma-AldrichD0632
Earle's balanced salt solution (EBSS)Gibco24010-043conatains 0.1% glucose
EDTASigma-AldrichE7889
Electroporation cuvette (4 mm)Bio-Rad1652088
Exponential decay wave electroporatorBTX Harvard Apparatus EMC 630
Fetal bovine serum (FBS)SigmaF752410% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cellsATCCCRL-1573
ImidazoleSigma-Aldrich56750Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubatorNuAireNU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher13778150
LNCaP cellsATCCCRL-1740use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA)Sigma-AldrichM9281Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated MicrocentrifugeBeckman Coulter Life Sciences368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode functionEppendorf Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi)Sigma-AldrichSML0702Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrumentErba DiagnosticsPL-II
MCF7 cellsATCCHTB-22
NADHMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzAxis-Shield1002424
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermoFisher31985062
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µl)VWR732-2223Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µl)VWR732-2207 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1000µl)VWR732-2355 Thermo Fischer ART Barrier tips
PipettesThermoFisher4701070Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407-10X5MGMake a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
PyruvateMerck-Millipore1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1)ATCCCRL-4000
RPMI 1640Gibco21875-037
SAR-405ApexBio A8883Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)ThermoFisher/Ambion4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)ThermoFisher/Ambions35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)ThermoFisher/Ambions18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)ThermoFisher/Ambions15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)ThermoFisher/Ambions18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)ThermoFisher/Ambions22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)ThermoFisher/Ambions24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)ThermoFisher/Ambions22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) Merck-Millipore1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) Prolabo28014.291
SucroseVWR443816T10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
ThapsigarginSigma-AldrichT9033Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405 Sigma-AldrichX4051% final
Trypan Blue stain 0.4%Molecular ProbesT10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)Gibco25200-056
Tween-20Sigma-AldrichP22870.01% final

Ссылки

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E., Bergmeyer, H. U. . Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). 2, 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

137autophagyautophagicphagophoreautophagosomeBafilomycinA1LC3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены