JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем протокол с использованием флуоресценции на месте гибридизации (FISH) для визуализации нескольких герпесвиральных РНК в литически инфицированных человеческих клеток, либо в подвеске или приверженцев. Этот протокол включает в себя количественную оценку флуоресценции, производящей нуклеоцитоплазмическое соотношение и может быть расширен для одновременной визуализации принимающих и вирусных белков с иммунофлуоресценцией (ИФ).

Аннотация

Механистический анализ приходит из тщательного изучения и количественной оценки конкретных РНК и белков. Относительное расположение этих биомолекул по всей клетке в определенное время может быть захвачено с флуоресценцией на месте гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (IF). Во время литической герпесвирусной инфекции вирус захватывает клетку-хозяина, чтобы преимущественно выражать вирусные гены, вызывая изменения в морфологии клеток и поведении биомолекул. Литические деятельности сосредоточены на ядерных заводах, называется вирусных репликации отсеков, которые заметны только с FISH и IF. Здесь мы описываем адаптируемый протокол РНК FISH и IF методы для Саркомы Апоши связанных герпесвирус (KSHV) инфицированных клеток, как приверженцев и в подвеске. Метод включает в себя шаги по разработке специфических антисмысловых олигонуклеотидов, двойной РНК FISH, РНК FISH с IF, а также количественные расчеты интенсивности флуоресценции. Этот протокол был успешно применен к нескольким типам клеток, неинфицированных клеток, скрытых клеток, литических клеток, временных курсов и клеток, обработанных ингибиторами для анализа пространственно-временной деятельности конкретных РНК и белков как от хозяина человека, так и КШВ.

Введение

В их литической (активной) фазе, герпесвирусы захватывают клетку-хозяина, вызывая изменения в морфологии клеток и локализации биологических молекул, для производства вирионов. Основой операций является ядро, где двухцепочечный геном ДНК вирусного реплицируется и упакован в белковую оболочку, называемую капсидом1. Для начала вирус выражает свои собственные белки, угон принимающей машины и предотвращения экспрессии несущественных генов хозяина, процесс, называемый эффект выключения хозяина. Большая часть этой деятельности локализована на конкретные 4 ",6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) свободных ядерных регионов, называемых вирусных репликации отсеков, состоящий из как принимающих и вирусных белков, РНК, и вирусной ДНК2. Ячейка капитально отремонтирована, чтобы обеспечить пространство и ресурсы для репликации отсеков и, таким образом, сборки вирусных капсидов. После того, как капсид выходит из ядра, как капсид окутан цитоплазмой для производства мембраны связанных вирусной частицы, также известный как вирион, неясно. Понимание локализации и пространственных сдвигов как хоста, так и вирусных биомолекул во время литической фазы обеспечивает более глубокое механистическое понимание расположения отсека репликации, эффекта выключения хозяина, пути выхода из virиона и других процессов, связанных с герпесвирусной инфекцией и репликацией.

В настоящее время лучшим методом обнаружения и изучения этих изменений является визуализация белков и РНК в инфицированных клетках с иммунофлуоресценцией (ИФ) и флуоресцентной гибридизации на месте (FISH), соответственно. Использование временного курса с помощью этих методов показывает локализацию биомолекул в ключевых точках литической фазы или просто пространственно-временных данных. FISH и IF дополняют другие биохимические методы, такие как ингибирование клеточного процесса (например, ингибирование репликации вирусной ДНК), RT-qPCR (цепная реакция полимеразы в реальном времени), секвенирование РНК, северные помарки, масс-спектрометрия, западная блоттинг и анализ производства вирусной ДНК, который может обеспечить более глобальную картину клеточной деятельности.

Мы разработали стратегии RNA FISH для изучения продуктов РНК из конкретных генов и вычислительного анализа, который количественно вычисляет нуклеоцитоплазмическое соотношение конкретного генного продукта. Подготовка образца, измененная из предыдущих публикаций Steitz и коллегами3,4,относительно проста и может быть использована как для приверженцев, так и для подвесных клеток. Протокол также адаптируется для одновременного использования нескольких стратегий РНК FISH (двойная РНК FISH) или RNA FISH со стратегиями IF. Разработка конкретной стратегии FISH является сложной задачей, но предложения по улучшению успеха изложены. Анализ данных, описанный здесь, является количественным, если используются флуоресцентные бусы и сильные маркеры границ отсека, и дает дополнительное представление о микрографах, понимание, которое устраняет предвзятость наблюдения. Подробный протокол предназначен как для скрытых, так и для литических клеток, инфицированных саркома-ассоциированным герпесвирусом Капоши (KSHV) и может быть использован с неинфицированными клетками или клетками, инфицированными другими герпесвирусами5. Методы количественной оценки применимы к исследованиям по нуклеоцитоплазматическим сдвигам или перелокализации между субклеточными отсеками в большинстве клеток.

протокол

1. Дизайн флуоресценции на месте (FISH) анти-чувство олигонуклеотидов для обнаружения конкретных герпесвиральных стенограммы

  1. Выберите от 25 до 40 nt сегментов из последовательности РНК интерес и конвертировать в анти-чувство. Успешная стратегия FISH может содержать от одного до десяти или более различных анти-смысл олигонуклеотидов. При выборе последовательностей следует учитывать следующее:
    1. Если РНК интереса содержит уникальный регион повторения, а затем извлечь выгоду из этой функции и разработать анти-чувство олигонуклеотида для целевой повторяют последовательность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Tycowski и коллеги5 представить пример этой стратегии с rhesus rhadinovirus (RRV) полиаденелаповой ядерной (PAN) РНК.
    2. Если РНК, интересующаяся содержит известный белково-связывающий участок или структуру стволовой петли, проектируйте олигонуклеотиды, которые избегают этих регионов.
    3. В зависимости от целей экспериментов, рассмотреть интронную последовательность и следует ли разрабатывать анти-чувство олигонуклеотида для него.
  2. Выполните простой вычислительный анализ выбранных антисмысловых последовательностей для обеспечения связывающей специфичности и уменьшения агрегации античувствеонного олигонуклеотида.
    1. Последовательности должны быть примерно 50% GC-богатых (высокое содержание гуанина и цитозина) и имеют температуру плавления в диапазоне от 60 до 70 градусов по Цельсию.
    2. Используйте инструмент анализа последовательности, чтобы выбрать последовательности, которые не самодимеризируют сяочку или не образуют шпильки с температурой плавления выше 37 градусов по Цельсию, температурой гибридизации.
    3. Выполните NCBI BLASTn (Национальный центр биотехнологии информации Основные местные выравнивания Search Tool для нуклеотидов выравнивания) поиск выбранных последовательностей против как хозяина и вирусных транскриптомов, используя "несколько аналогичных" настройки. Этот поиск позволит определить уникальные анти-чувство олигонуклеотидов, которые, вероятно, не связываются с другими хостом или вирусных стенограмм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если транскриптомы недоступны, выполните поиск BLAST с геномными последовательностями. Идеально, если поиск выполняется по последовательностям от вируса, изолированного от инфицированных клеток, используемых в эксперименте, потому что дикие штаммы, как правило, диверсифицируют и содержат комбинацию последовательностей из различных лабораторных штаммов.
  3. Закажите очищенные ДНК-олигонуклеотиды, соответствующие антисмысленной последовательности, которая была проверена вычислительно, чтобы быть уникальной и, вероятно, связываться с целевой РНК. Никаких специальных модификаций в олигонуклеотиды вводить не нужно.
  4. Испытайте разработанные антисмысловые олигонуклеотиды на обязательную специфичность FISH и Northern blot.
    1. Используя неинфицированную клеточную линию от одного и того же вида-хозяина (например, 293T) и в идеале одного и того же типа клеток, проведите трансфекцию с плазмидом, выражающий интерес РНК со стороны надежного промотора (CMV, цитомегаловирус) и с пустым вектором (например, pcDNA3). Используйте положительный контроль для трансфекции, такие как со-трансфекция с ГФП (зеленый флуоресцентный белок) плазмид (например, pmaxGFP) или вектор, содержащий GFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы избежать клеточных линий, которые были увековечены с помощью вируса эппесина-Барра (EBV), поскольку Есть последовательность сходства между герпесвирусами.
    2. Выполните FISH, как описано в разделе 3 на обоих наборах клеток с анти-чувство олигонуклеотидов, как описано в этом протоколе. Вывести успешных кандидатов, сравнивая FISH эксперименты с отдельными, пары, или наборы анти-чувство олигонуклеотидов. Используйте положительный контроль для протокола FISH, таких как U2 snRNA (малая ядерная РНК) FISH, присутствующих на 500000 копий на ядро клетки человека6 (Таблица 1).
    3. Флуоресцентный сигнал должен быть специфическим и сильным в клетке, содержащей РНК интереса. Дизайн дополнительных анти-чувство олигонуклеотидов для укрепления сигнала и удалить анти-чувство олигонуклеотиды, которые связывают неспецифически от рассмотрения. Сила сигнала должна быть выше фона и автофлюоресценции.
    4. Испытание связывающей специфичности по Северному помету.

2. Олигонуклеотид и клеточная подготовка

  1. Следуя инструкциям производителя, используйте терминальной трансферазы для обозначения антисмысловых олигонуклеотидов диоксигенином (DIG)-DUTP или, если сильно связывающими, непосредственно с флуоресцентным нуклеотидом, таким как Alexa Fluor 594-5-dUTP. После маркировки дополнительная очистка не требуется. Магазин помечены олигонуклеотиды на -20 градусов по Цельсию до нескольких лет и в фольге, если непосредственно помечены для предотвращения фотоотбелекирования.
    ВНИМАНИЕ: Решение для маркировки содержит токсичный материал, калий какодилат. Ручка маркировки реакции с перчатками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сохранения ресурсов, несколько различных анти-чувство олигонуклеотиды могут быть помечены в одной реакции. Этот протокол использует 3'конец маркировки. Внутренняя маркировка является сложной задачей, поскольку химическая группа (например, DIG или фторфор) попадается или не может войти в активный участок полимераза ДНК. Эксперимент с двумя различными РНК может быть выполнен с использованием прямо йогонуклеотидов и анти-DIG иммунофлуоресценции с различными флюорофорами (например, FITC (флуоресцеин) или Alexa Fluor 488 с Alexa Fluor 594).
  2. Придерживайтесь ячеек к восьмикамерным горок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Восьмикамерные слайды позволяют несколько одновременных экспериментов при минимизации драгоценных ресурсов, таких как антитела. Альтернативой восьмикамерным слайдам является шестикомнатная пластина культуры тканей со стандартными крышками (22 мм х 22 мм), которые являются стерильными. Аналогичное расположение возможно с круговыми крышками и 24-хорошо пластины культуры ткани. Для обоих увеличить объемы, упомянутые в этом протоколе, на 10-15 x (например, 1,75 мл решения гибридизации) и 4x (например, 600 л решения гибридизации) соответственно.
    1. Для приверженных литические клетки, используйте 1x трипсин / PBS на 37 КС и 5% CO2 в течение 10 минут, чтобы приостановить клетки и разбавить до 60% выпуклости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приверженные клеточные линии, используемые в экспериментах FISH, включали 293T, iSLK.2197и iSLK-BAC36 ячеек8.
    2. Нанесите 200 л клеточной подвески на каждую камеру стерильных восьмикамерных слайдов и допускайте ростсемян в течение 12-24 ч при 37 градусах Цельсия и 5% CO 2. Отрегулируйте по мере необходимости для медленно- или быстрорастущих клеток и для клеток, которые легко повреждаются трипсином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы иметь равномерно расположенные ячейки, прочно прикрепленные к слайду. Рассмотрим индуцирование литической фазы после сливки, если литические клетки являются хрупкими. Выводы, сделанные из экспериментов с клетками iSLK, ограничены9.
    3. Для литик-клеток подвески, предварительно лечить восьмикамерные слайды с 1:10 поли L-лизин в течение 5 минут под капотом культуры ткани. Затем оставьте горки высохнуть на ночь при комнатной температуре или 1 ч при температуре 65 градусов по Цельсию. Инкубировать 800 л литических клеток в концентрации 1 х 106 клеток/мл с камерными горками в течение 30 мин до 1 ч при 37 КС и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подвесные клетки оседают в монослой, прилипая к поли L-лизин и, таким образом, избыточные клетки не являются проблемой по сравнению с клетками адептов. Литические клетки, образующие виноградные скопления, по возможности, должны быть разделены нежным вихрем или химическими средствами. Правда, авторы не имели большого успеха с такими рекомендациями в случае литические BJAB-RRV-GFP клеток. Если подвесные клетки не прилипают хорошо, рассмотреть вопрос об увеличении времени или концентрации поли L-лизин инкубации.

3. Фиксация, иммунофлуоресценция (необязательно), гибридизация и визуализация вирусных РНК

  1. Удалите носители и избыточные ячейки. На протяжении всего этого протокола, использовать вакуум всасывания для удаления решений и нежный микропиптинг, чтобы добавить решения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прочность вакуума может быть уменьшена путем размещения 200 йл микропайпет анаосии над стеклом Пастер пипетка. Замените наконечник micropipette между шагами мытья для предотвращения загрязнения. Каждый шаг мытья должен быть выполнен быстро, потому что крайне важно, чтобы клетки никогда не высыхают.
  2. Немедленно, исправить клетки с предварительно охлажденной 4% формальдегида / PBS (фосфат-буферный солевым раствором) на льду в течение 30 мин. Вымойте клетки три раза с 200 Л Л 1x PBS охлаждается до 4 градусов по Цельсию и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре или на льду.
    1. Пермяки фиксированная клетка с 200 qL предварительно охлажденного 0,5% Triton-X/PBS (фосфат буферный солен) в течение 10 мин на льду или 750 л предварительно охлажденного 70% этанола при 4 кс на 1 ч (мин) до 7 d (максимум).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор белка, общей РНК, и геномных образцов ДНК в точке фиксации для обеспечения согласованности между изображениями и биохимических анализов. Все смывы на протяжении всего протокола выполняются одинаково, если не указано иное. 70% этанола ослабляет клей между камерами и слайдом, что облегчает последующее разделение, а также обеспечивает значительную паузу в протоколе. Тем не менее, используйте парафина пленка вокруг камеры слайд, чтобы уменьшить испарение и проверить уровень этанола в каждой камере около каждые 8 ч. 70% этанола также уплощает клетки, делая четкое изображение, в то время как Triton-X не обезвоживает клетки и изменить размеры ячейки.
  3. Тщательно удалите камеры, чтобы предотвратить растрескивание слайда. Если эксперимент включает в себя иммунофлуоресценцию (IF) вирусного или принимающего белка с поликлональным первичным антителом, выполните IF, как описано ниже, прежде чем приступить к РНК FISH. Если иммунофлуоресценция использует моноклональные первичные антитела, то выполнять иммунофлуоресценции, как описано в шаге 3.3.1 после шага 3.11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новое устройство удаления или один с очень мало остатков клея, предоставляемых производителем и мягко облегчить камеры, чтобы предотвратить слайд от растрескивания. Использование 70% этанола в качестве пермякового реагента на 4 ч значительно снижает вероятность растрескивания. В случае трещины продолжайте протокол на камерах, не затронутых трещиной, и помните о более высокой скорости окисления несовершенно запечатанных слайдов (т.е. уменьшенного срока хранения).
    1. Промыть клетки с предварительно охлажденной 1x PBS и блок с предварительно охлажденной 4% BSA (бувин сыворотки альбумина) /1x PBS в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование BSA на протяжении всего этого протокола ограничивает неспецифическую маркировку.
    2. Удалить блокирующий раствор и инкубировать клетки с 1:200 или другой поликлональных первичных антител в 0,1% BSA/1x PBS для 1 ч при 4 c. Затем промыть три раза с 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитело10 для обнаружения SSB/ORF6 (вирусный одноцепочечный связывающий белок ДНК) было использовано в 1:200 разбавления.
    3. Инкубировать клетки вторичным антителом с фторфором, совместимым с FISH-обнаруживающим антителом в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия. Вымойте три раза с 1x PBS. Затем исправить с 4% формальдегида / 1x PBS в течение 10-15 мин и permeabilize либо Тритон-X или 70% этанола, как ранее описано, прежде чем приступить к FISH. Крышка слайд с фольгой оберморка для сохранения флуоресцентного сигнала и предотвращения фотоотбеления.
  4. Вымойте клетки с 2x SSC (соленовый цитрат натрия) один раз, а затем применить 45 мл раствора гибридизации, состоящий из 50% формамида, 10% декекрон сульфат, 2x SSC, 0,1% BSA, 500 мкг/мл лосося ДНК, 125 мкг/мл E. coli tRNA, и 1 mM Комплексов. Инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия в камере влажности, которая может быть 150 мм чашкой Петри с увлажненные стерильные салфетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежее решение гибридизации по крайней мере за час до использования. Растворите декстран сульфат в воде во-первых, вихрь часто и инкубации в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
  5. Рассчитайте, чтобы иметь рекомендуемую концентрацию 25 мкм олигонуклеотидов в 35-uL гибридизации раствора на камеру. Отрегулируйте концентрацию античувствеонного олигонуклеотида по мере необходимости. Добавьте дистиллированную воду в олигонуклеотиды, чтобы довести объем денатурации до 10 зл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После реакции маркировки, олигонуклеотиды хранятся в утоленном растворе, содержащем 0,18 М калийный какодилат, 23 мм Трис-ХЛ, 0,23 мг/мл БСА, 4,5 мМ CoCl2,18 мМ EDTA, 2,7 мМ К-фосфат, и 6,8 мм КЛ, 45 ММ 2-Меркапана 0.02% Тритон X-100, и 2% глицерола. Концентрации достаточно высоки, что разбавление водой приведет к денатурации раствор концентрации вблизи 1x TE (10 мм Tris-HCl и 1 мм EDTA), стандартный буфер денатурации олигонуклеотида.
  6. Денатурировать DIG- и / или Alexa Fluor 594-маркированные олигонуклеотиды при 95 кв кс в течение 5 мин. Затем добавьте 35 йл свежего раствора гибридизации на предназначенную камеру к денатурированным олигонуклеотидам. При выполнении двойной FISH, оба набора анти-чувство олигонуклеотиды могут быть денатурированы и гибридизированы вместе.
  7. Удалите решение предварительной гибридизации, а затем добавьте в клетки раствор гибридизации, содержащий помеченные олигонуклеотиды. Инкубировать ночь в камере влажности при 37 градусов по Цельсию с оловяной фольгой для защиты флурофора помечены олигонуклеотидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация должна быть не менее 10 ч и не более 24 ч.
  8. На следующий день, мыть клетки дважды с 2x SSC в течение 10 минут при 37 градусов по Цельсию, а затем дважды с 1x SSC в течение 10 минут при 25 градусов по Цельсию.
  9. Зафиксировать клетки с предварительно охлажденным 4% формальдегидом/1x PBS в течение 10-15 мин на льду. Затем мыть клетки с PBS три раза и permeabilize в течение 1 ч с предварительно охлажденной 70% этанола или в течение 10 минут с предварительно охлажденной 0,5% Triton-X/1x PBS при 4 c.
  10. Инкубировать клетки с 1:200 анти-DIG FITC в предварительно охлажденной 0,1% BSA/1x PBS для 1 ч при 4 C. Удалить раствор антитела и промыть три раза с 1x PBS.
  11. Исправить с предварительно охлажденным 4% формальдегида/1x PBS в течение 10-15 мин при 4 C, а затем мыть три раза с 1x PBS. При выполнении иммунофлюоресценции для хозяина или вирусного белка с моноклональным первичным антителом, permeabilize клеток, а затем выполнить протокол IF, изложенные в шаге 3.3.1. В противном случае перейти к DAPI окрашивания.
  12. Инкубировать клетки с 0,4 мкг/мл DAPI в предварительно охлажденных 0,5% Triton-X/1x PBS в течение 15 минут на льду, а затем мыть три раза с 1x PBS.
  13. Горные горки с флуоресцентными бусинами (по желанию) и монтажной средой. Затем запечатайте крышку на слайдс с прозрачным лаком для ногтей.
  14. Используя конфокальный микроскоп, собирайте изображения образцов в течение часа до недели после выполнения протокола при увеличении 630x. Нанесите несколько слоев лака для ногтей, чтобы запечатать крышку скольжения и продлить жизнь фторфора за счет снижения скорости окисления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте dAPI-содержащий монтажную среду. При сборе изображений включите панель масштаба на каждом изображении для последующей количественной оценки. Флуоресцентные бусы служат в качестве контроля интенсивности флуоресценции между слайдами и образцом препаратов11. Приобретайте изображения в средней части ячейки для двумерной (2D) количественной оценки в шаге 4.

4. Количественная оценка изображений FISH и IF для выделения субклеточной локализации и определения нуклеоцитоплазмического соотношения флуоресценции

  1. Выполните анализ изображений на собранном стеке различных флуоресцентных окрашенных и слитых изображений для обеспечения согласованности. Установите масштаб программного обеспечения для анализа изображений с помощью панели шкалы, включенной при сборе изображений.
  2. Для количественной оценки интенсивности флуоресценции по нескольким каналам и в отношении ядерного пятна DAPI используйте линейный инструмент и функцию сюжетного профиля. Затем укажите строку постоянно на копии изображения с помощью маркеров, которые не препятствуют или влияют на суждения зрителя.
    1. Установить критерии, чтобы направлять, где линия обращается, например, след, который захватывает разнообразие топографических особенностей, пиков и долин, вдоль центральной оси или линии, которая не пересекает перенасыщенных областях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти следы линии изображают сырую флуоресценцию в клетке и, таким образом, ограничиваются сравнениями местоположения пятна, а не интенсивности. Чтобы сравнить интенсивность одного и того же пятна между слайдами, процедурами или препаратами, добавьте флуоресцентную бисна к слайду в качестве внутреннего контроля во время шага 3.13. Флуоресцентный бусиной должен быть добавлен во время процесса монтажа и обнаружен с теми же настройками на возбуждающей лазерной и фотомультипликаторной трубке (конфокальной).
  3. Чтобы количественно определить сдвиг в субклеточной локализации, вычислить нуклеоцитоплазматические соотношения клеток, проходящих различные процедуры.
    1. Измерьте площадь и интенсивность сырой флуоресценции как ядра, так и цитоплазмы, используя ядерное пятно DAPI для установки внутренней границы. Включите элементы элемента ядерного и цитоплазмического контроля, такие как ядерная РНК (например, КШВ ПАН РНК) и цитоплазматическая РНК (например, хост GAPDH mRNA). Кроме того, рассчитать интенсивность фона для трех клеточных областей и усреднение значений на пиксель или мкм2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения интенсивности, как правило, не хватает единиц и поэтому термин "единицы" используется.
    2. Нормализовать как ядерные, так и клеточные значения интенсивности сырья, сначала определив средний фон для одной и той же области, а затем вычитая это индивидуализированное значение из необработанной интенсивности области.
      1. Например, ядро литической В-клетки имеет площадь 133,4 мкм2 и сырую интенсивность 75976 единиц, в то время как фоновая интенсивность для того же флуоресцентного сигнала была определена в 0,67 единиц на мкм2. Нормализованная ядерная интенсивность будет
        figure-protocol-18915
    3. Введите значения в следующем уравнении.
      figure-protocol-19072
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот расчет контролирует изменения в субклеточной области. Литическая индукция и медикаментозное лечение может увеличить ядро или изменить размер клетки, соответственно.
    4. Чтобы интерпретировать результаты, создайте участок усов коробки. Равное распределение флуоресцентного сигнала будет близко к нулю, в то время как ядерное распределение будет способствовать положительному значению соотношения, а цитоплазмическое распределение будет направлено в сторону значения отрицательного соотношения.

Результаты

Методы FISH и IF, описанные в данной рукописи, показаны на рисунке 1 наряду с количественной оценкой результатов по линейным следам флуоресцентной интенсивности. Представленные здесь результаты являются полуколичественными и дают представление о локали...

Обсуждение

Протокол, описанный в настоящем докладе, может быть адаптирован к различным типам клеток и включает в себя шаги для двойной РНК FISH и RNA FISH с IF с использованием как моноклональных, так и поликлональных первичных антител. Хотя подготовленные слайды, как правило, изображены с конфокальный м...

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Мы благодарим Джонатана Роденфельса, Казимира Тычовски и Джоанну Б. Уизерс за советы по анализу данных. Мы также благодарим Г. Хейворд за анти-SSB антитела. Эта работа была поддержана грантами T32GM007223 и T32AI055403 от Национальных институтов здравоохранения (для ТКВ) и грантом NIH (CA16038) (для JAS). JAS является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза. Цифры 1-3 и таблица 1 были воспроизведены с разрешения Американского общества микробиологии под лицензией Creative Commons Attribution из следующей публикации: Валлери, Т. К., Уизерс, Дж.Б., Андо, Дж.А., Штейтц, Саркома-Ассоциированные Дж.А. Капоши Накопление герпесвируса мРНК в ядерной foci зависит от вирусной репликации ДНК и вирусного некодирования полиаденинатной ядерной РНК. В журнале вирусологии. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AlexaFluor594-5-dUTPLife TechnologiesC1100
anti-DIG FITC Jackson Lab Immunologicals200-092-156
Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal AntibodyInvitrogenA-11037Goat
Anti-SSB AntibodyN/AN/ARef. Chiou et al. 2002
BLASTnNIH NCBIN/AFree Sequence Alignment Software
Dextran SulfateSigma AldrichD8906Molecular Biology Grade
DIG-Oligonucleotide Tailing KitSigma Roche#033535839102nd Gen
Eight-Chamber SlidesNunc Lab Tek II#154453Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. 
FormamideSigma AldrichF9037Molecular Biology Grade
GAPDH ProbesStellarisSMF-2019-1Compatible with protocol, Quasar 670
ImageJ NIH, Bethesda, MDN/AFree Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzerIDTN/AFree Oligonucleotide Analyzer 
pcDNA3InvitrogenA-150228
pmaxGFPAmaxaVDF-1012
Poly L-LysineSigma AldrichP8920
Terminal TransferaseSigma Roche#003333574001
Vanadyl Ribonucleoside Complexes NEBS1402S
VectashieldVector Laboratories, Inc. H-1000DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. 

Ссылки

  1. Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  3. Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
  4. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
  5. Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
  6. Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  9. Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
  10. Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
  11. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  12. Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
  13. Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
  14. Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
  15. Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
  16. Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
  17. Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
  18. Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150FISHIFKSHV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены