Модель баллона для венопластики нижней полой вены грызуна

Резюме

В протоколе представлена модель выживания грызунов для тестирования вмешательств с помощью баллона венопластики (VB) в нетромботических, тромботических и посттромботических глубоких венах.

Аннотация

Баллонная венопластика является широко используемым клиническим методом лечения стеноза глубоких вен и окклюзии в результате травмы, врожденных анатомических аномалий, острого тромбоза глубоких вен (ТГВ) или стентирования. Хроническая обструкция глубоких вен гистопатологически характеризуется тромбозом, фиброзом или и тем, и другим. В настоящее время не существует прямого лечения для борьбы с этими патологическими процессами. Таким образом, необходима надежная животная модель in vivo для тестирования новых вмешательств. Модель баллонной венопластики (VBM) выживаемости грызунов в нижней полой вене (IVC) позволяет изучать баллонную венопластику при нетромботических и посттромботических состояниях в различные временные точки. Местный и системный эффект баллонов венопластики с покрытием и без покрытия может быть количественно определен с помощью анализов тканей, тромбов и крови, таких как полимеразная цепная реакция в реальном времени (ОТ-ПЦР), вестерн-блоттинг, иммуноферментный анализ (ИФА), зимография, клеточный анализ стенок вен и тромбов, анализы цельной крови и плазмы, а также гистологический анализ. VBM воспроизводим, воспроизводим, воспроизводит хирургические вмешательства человека, может идентифицировать локальные изменения белка стенки вены и позволяет проводить несколько анализов одного и того же образца, уменьшая количество необходимых животных в группе.

Введение

Обструкция глубоких вен из-за неустраненных тромбов является распространенным последствием тромбоза глубоких вен (ТГВ) и является одной из причин посттромботического синдрома (ПТС), обходясь в миллиарды долларов в здравоохранение и значительно влияя на качество жизни ^1,2,3. ПТС является уникальной воспалительной патологией с последующим фиброзом стенки вены⁴, который не полностью отражен в моделях ТГВ мелких животных ^5,6,7, и, что более важно, предыдущие модели не могут оценить реакцию на терапевтические вмешательства. Тромботические венозные обструкции часто лечатся стентированием и баллонной венопластикой ^8,9; Такие вмешательства затруднены высокой частотой повторных вмешательств из-за рестеноза и окклюзии 10,11,12.

Несмотря на наличие баллонов с лекарственным покрытием для лечения артериально-специфических стенозов/окклюзий, для глубоких вен их не существует. Молекулярный механизм рестеноза в венах плохо изучен и не имеет прямой терапии⁴. Таким образом, наша цель состоит в том, чтобы представить животную модель, которая может тестировать местную терапию с помощью баллонов венопластики, имитирующих посттромботическую обструкцию глубоких вен. Эта модель воспроизводит посттромботическое состояние и оценивает, как различные типы баллонов венопластики влияют на стенку вены in vivo.

протокол

Следующий протокол соответствует политике и рекомендациям Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Мичиганского университета (UMICH), Принципам правительства США по использованию и уходу за позвоночными животными, используемыми при тестировании, исследованиях и дрессировке, а также рекомендациям ARRIVE. Соглашение UMICH о благополучии животных соответствует требованиям OLAW и USDA и полностью аккредитовано AAALAC International. Данный протокол был утвержден с идентификационным номером PRO00010841. Использовались самцы аутбредных крыс Sprague Dawley от Charles River Laboratories весом 450 г и возрастом 15 недель.

1. Крысиная анестезия

1. Извлеките животных из клетки и поместите их в анестезирующую предоперационную индукционную газовую камеру с 5% изофлураном и 100% кислородом со скоростью потока от 0,8 до 1 л/мин (контролируемая испарителем) для индукции общей анестезии.
2. Усыпить крыс в камере индукции анестетика, извлечь их из камеры, взвесить, смазать их глаза стерильной офтальмологической мазью, а затем поместить их в спинное лежачее положение на теплое водонагревательное устройство. Подтвердите достаточную глубину анестезии с помощью педального рефлекса (твердое защемление пальца ноги).
3. Побрейте брюшную полость с помощью электрических машинок для стрижки. Поддерживайте общую анестезию на уровне 2,5% изофлурана и 100% кислорода со скоростью от 0,8 до 1 л/мин с помощью контура без повторного дыхания через носовой конус.

2. Ультразвуковое сканирование крыс

1. Контролируйте физиологические показатели, включая частоту дыхания, частоту сердечных сокращений и температуру, во время визуализации.
2. Для визуализации нижней полой вены (НПВ) нанесите проводящий гель и поверните датчик в поперечное положение. При предварительной настройке периферических сосудов используйте режим двумерной визуализации или B-режим, опустите линейный зонд (10 МГц) на центр брюшной полости, регулируя глубину давлением до тех пор, пока не появятся сосуды брюшной полости.
3. Дифференциация НПВ от брюшной аорты путем оценки сжимаемости и оценки потока с использованием как цветного, так и импульсно-волнового режима допплера с высокочастотным линейным зондом (10 мГц).
   1. При выполнении компрессии с помощью ультразвукового датчика дифференцируйте их, так как НПВ является сжимаемым, в то время как аорта сохраняет свою форму и проходимость.
4. Оцените направление и скорость кровотока с помощью цветного и импульсно-волнового допплера. Цветное доплеровское окно представляет поток к зонду красным цветом и отток от преобразователя синим цветом. Переключите прибор в режим импульсно-волновой допплерографии (дуплексный режим), чтобы оценить направление и скорость кровотока с течением времени. Получение необходимых изображений потока с помощью автоматизированного инструмента захвата изображений ультразвукового аппарата (точные характеристики получения изображений могут отличаться в зависимости от ультразвуковой системы).
   1. Используйте следующий метод оценки: аорта имеет приток крови к зонду и трехфазную волну, в то время как НПВ имеет спонтанный отток от зонда с гораздо меньшей амплитудой.
   2. Если проксимальный НПВ демонстрирует нормальную форму волны, но дистально обнаруживается бесфазная или отсутствующая (плоская) форма волны, исследуйте возможность венозной обструкции между этими точками исследования.
5. После того, как НПВ будет обнаружен, определите средний отдел, который находится в средней трети отдела, ниже почечных вен и выше бифуркации НПВ, скорее всего, там, где расположены поясничные вены.
6. Измерьте в среднем сечении IVC диаметр от стенки до стенки в поперечном виде с помощью изображения поперечного сечения B-моды, зафиксировав самый широкий диаметр сосуда. Получение изображений может отличаться в разных ультразвуковых аппаратах. Храните данные с помощью компакт-дисков (CD) в файлах DICOM.

3. Микрохирургия и восстановление крыс

1. Очистите брюшную полость скрабом, смоченным в марле, и раствором хлоргексидина 3 раза, чтобы обеспечить асептическое хирургическое состояние.
2. Поместите стерилизованную пищевую пленку в качестве хирургической пленки, чтобы закрыть грудную клетку крысы и область живота, ручки микроскопа (увеличение и фокусировка) и окуляр.
3. Сделайте вентральный разрез по средней линии (3 см) примерно на 2 см ниже мечевидного отростка ножницами радужной оболочки через кожу и брюшную стенку, обнажая содержимое брюшной полости. Используйте стерильную марлю, пропитанную физиологическим раствором, размером 2 x 2 дюйма, чтобы отразить кишечник в правую сторону животного.
4. Для воздействия НПВ выполните тупое рассечение с помощью стерильного аппликатора с ватным наконечником. Поместите проволочное зеркало в разрез, чтобы обеспечить визуализацию НПВ.
5. Прижгите все ветви поясницы IVC с помощью низкотемпературного прижигания тонкого кончика, от почечных вен до бифуркации подвздошной кости, и перевяжите боковые ветви 7-0 нерассасывающимися полипропиленовыми швами.
6. Поместите проксимально изогнутый сосудистый микрозажим на НПВ, который отделен от аорты и находится чуть ниже почечных вен. Поместите прямой микрозажим на дистальный отдел НПВ, который отделен от аорты и находится выше бифуркации НПВ.
7. Ставка 8-0 нейлоновый U-образный шов каудально к левой почечной вене с центром на передней поверхности НПВ.
8. Вставьте заточенный проводник на 0,014 мм с обратным баллоном венопластики, ретроградно к кровотоку в инфраренальный НПВ, каудально к изогнутому микрозажиму.
9. Переместите воздушный шар в середину IVC, используя технику Сельдингера. Снимите заточенный проводник и надувайте баллон для венопластики в течение 3 минут с перенапряжением от 10% до 15% НПВ с помощью шприца объемом 20 мл для создания положительного давления в диапазоне 0-30 атм. Промойте все системы стерильным физиологическим раствором перед канюляцией НПВ, чтобы избежать воздушной эмболии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: НПВ диаметром 2,8 мм подвергнется венопластике до 3,22 мм (15% растяжения). Необходимое давление накачивания для достижения желаемого перенапряжения определяется характеристиками баллона и доступно на упаковке производителя.
10. Затяните U-образный шов после венопластики, баллонной сдувания и удаления. Снимите микрозажимы.
11. Закройте место лапаротомии в два слоя. Используйте рассасывающийся синтетический шов 5-0 полиглактина непрерывным способом, чтобы закрыть как брюшную стенку, так и кожу.
12. Вводите бупренорфин в инъекционной суспензии с пролонгированным высвобождением, 0,65 мг/кг подкожно (ПКК) после операции в качестве анальгетика для крыс, поскольку он не влияет на панели биомаркеров воспалительных молекул для анализа белка.
13. Восстановите крыс в индивидуальной клетке, понаблюдайте после операции (30 мин) под нагревательной лампой (минимальное расстояние - 24 дюйма от клетки), а затем вернитесь в их исходные жилища.
14. Для фиктивных животных из каждой экспериментальной группы проводят только диссекцию, без лигирования ветвей НПВ, прижигания и канюляции.
15. При посттромботических состояниях поместите проксимальный прямой сосудистый микрозажим на НПВ, который отделен от аорты, чуть ниже почечных вен, на 24 ч. Используйте те же методы рассечения и закрытия.
    1. Проверьте наличие ультразвуковых признаков окклюзии НПВ, которые включают визуализацию клипсы НПВ, подтверждение дистального отдела НПВ без кровотока и расширения общих подвздошных вен. Временные точки последующего наблюдения могут быть настроены в соответствии со спецификациями исследования.
    2. Чтобы наблюдать за моделируемыми физиологическими изменениями, выберите временные точки в первые 72 ч для раннего образования тромбов и от 3 до 7 дней после процедуры для более позднего разрешения тромбов. Более поздние временные точки, протестированные в этой модели, включают от 7 до 28 дней ^5,13.
16. Используйте методы, описанные на шагах 3.5-3.9, для посттромботической баллонной венопластики со следующими оговорками: Для достижения желаемого перенапряжения может потребоваться более высокое давление инсуффлейтора, поскольку диаметр IVC увеличивается в посттромботических условиях.
17. Выполняйте эвтаназию в соответствии с рекомендациями, изложенными в действующем Руководстве Американской ветеринарной медицинской ассоциации по эвтаназии для грызунов, выполняя два подтверждающих метода (удаление крови и удаление жизненно важных органов), чтобы гарантировать, что животное не оживет.

Рисунок 1: Распределение трансабдоминальных дуплексных измерений поперечного диаметра IVC (среднеинфраренального сечения). Измерение проводилось по весу животного. Достоверной корреляции между весом и диаметром НПВ не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Подготовка образцов

1. Выполните подтверждающий перенос тканей баллонов венопластики с лекарственным покрытием с использованием высокоэффективного метода жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
2. Рассеките НПВ и аорту и удалите их целиком для встраивания парафина, зафиксированного формалином, и гистологического анализа.
3. Для анализа белка используйте буфер RIPA в разбавляющей концентрации 60 000 мкг/г образца, обрабатывайте тканевым гомогенизатором в условиях низкой температуры при температуре 4 °C и храните при -80 °C после обработки.

Результаты

VBM – это модель, которая оценивает эффект баллонов венопластики при полном контроле гемостаза. Во-первых, мы количественно измерили диаметр IVC (среднеинфраренального сечения), как показано на рисунке 1, для правильного определения размера баллона. Во-вторых, разработанн?...

Обсуждение

VBM может быть выполнена на крысах ≥ 250 г с использованием баллонов в диапазоне 2,5-3,5 мм. Для крыс весом более 750 г этот метод ограничен большим количеством жировой ткани в брюшной полости и размером органа, а не изменениями диаметра НПВ. Исходя из нашего опыта, мы обнаружили, что для получен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 DemeCRYL	DemeTech	G183019F4P	12 per box
5-0 DemeCRYL	DemeTech	G285017B0P	12 per box
7-0 DemeLENE	DemeTech	PM197011F13M	12 per box
8-0 DemeLON	DemeTech	NL868007C7P	12 per box
Angled Clip Applier	SCANLAN	3795-01A	7-1/4″ (18.5 cm)
Baxter 0.9% Sodium Chloride Irrigation Bottle	Baxter	SKU: 195-7124	1000mL Bottle
Bovie Cautery Low Temperature Fine Tip	Symmetry Surgical Inc	AA00	10/bx
Buprenorphine	Fidelis Animal Health	SKU- 099114	1.3mg/mL, 3mL
CD (Sprague Dawley) Rats	Charles River	Strain Code 001	Male, 400 gm
Clip-It Traceable Timer	TRACEABLE PRODUCTS	Cat. No. 5046
Cotton-Tip Applicator 3"	Dukal Corporation	922-00037BX100	1000/BOX
Enzymatic Surgical Instrument Detergent and Presoak	Medline	MDS88000B9	1 Gal
Eye Lube	Optixcare	SKU-065441	20gm
Gaymar T/Pump Stryker Localized Warming/Cooling Therapy System	Stryker	TP700
Heifetz Microclips 12mmx2.25mm	SCANLAN	3795-20	Straight
Heifetz Microclips 12mmx2.25mm	SCANLAN	3795-28	Curved
Heifetz Microclips 8mmx1.75mm	SCANLAN	3795-14	Straight
Heifetz Microclips 8mmx1.75mm	SCANLAN	3795-18	Curved
Inflation device	Merit Medical	IN4130	BasixCOMPAK with Analog Display
Isoflurane	MFR VETONE	SKU-501017	100mL, Liquid for Inhalation
Microsurgery kit containing tweezers and forceps	Customized
Oxygen, E-tank	Medline	MDM1630
Sharpened Guidewire	Customized
Sterile Glad Press-n-Seal	Glad	SKU # PSS-140	ETO Exposed
Sterile Nonwoven Gauze Sponges 2s 4ply 4x4	Medline	SKU PRM21444H	100Ct
Surgical microscope	Zeiss	S100 / OPMI pico
Surgical Scrub & Handwash	Vetoquinol	NDC: 17030-003-16	16 oz
Ultrasound Gel	Medline	CTR001305	8.5 oz, 12/CS
Ultrasound system	Siemens	ACUSON Antares	3-D, Color, Continuous wave (CW), Pulsed wave (PW), Power CW/CW Spectral
Venoplasty Balloon	Customized