JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для количественной оценки пространственно-временной динамики активации Akt и фосфорилирования в живых клетках HepG2. Визуализация резонансного переноса энергии (FRET) компании Förster является мощным инструментом, который позволяет получить ценную информацию о сигнальных путях инсулина и метаболической регуляции в раковых клетках.

Аннотация

Метаболически регулируемая активация Akt является критическим узлом в каскаде передачи сигналов инсулина и дает ценную информацию о взаимосвязи между диабетом и раком. Чтобы точно количественно оценить активность Akt в клетках HepG2, мы разработали надежный, воспроизводимый протокол, использующий резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) с генетически закодированными Akt-специфичными биосенсорами. В этом протоколе подробно описаны этапы культивирования клеток, подготовки чашки для визуализации и трансфекции клеток HepG2 для экспрессии биосенсоров на основе FRET, а также конкретные рекомендации по настройке аппаратного и программного обеспечения лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Результаты продемонстрировали уникальные паттерны передачи сигналов инсулина в клетках HepG2, которые демонстрируют необратимое переключение, характеризующееся конститутивной активацией Akt с определенным порогом включения, но без порога выключения. В отличие от них, миотрубки имеют реверсивный переключатель. Персистирующая активация Akt в клетках HepG2 предполагает механизмы, лежащие в основе резистентности к инсулину и метаболической дисрегуляции в клетках печени, с более широкими последствиями для понимания прогрессирования метаболических нарушений и рака. Этот протокол предлагает ценную основу для изучения связанных с Akt сигнальных путей и клеточного поведения в различных контекстах заболевания.

Введение

Сахарный диабет представляет собой серьезную глобальную проблему здравоохранения, характеризующуюся резистентностью к инсулину и нарушением гомеостаза глюкозы1. Всестороннее понимание сигнальных путей инсулина имеет решающее значение для выяснения патофизиологии этого заболевания, поскольку инсулин играет ключевую роль в метаболизме глюкозы, росте клетоки выживаемости. Многочисленные исследования показали, что передача сигналов инсулина значительно влияет на различные виды рака, связывая резистентность к инсулину с прогрессированием опухоли и плохими исходами лечения пациентов 3,4,5,6. Клетки HepG2, широко используемая клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы, служат ценной моделью для изучения резистентности к инсулину и взаимодействия между метаболической дисрегуляциейи развитием рака. Традиционно исследователи рассматривали реакцию инсулина как градуированную; Тем не менее, недавние исследования показали, что отдельные клетки могут проявлять бистабильные ответы, демонстрируя заметные переходы между отсутствием реакции и полным ответом, происходящие при определенных пороговых значениях концентрации инсулина 8,9.

Визуализация резонансного переноса энергии (FRET) Фёрстера является мощным инструментом для изучения пространственно-временного распределения биомолекул в живых клетках10. Извлекая информацию из молекулярной динамики, FRET дает представление о таких процессах, как активация Akt, в режиме реального времени, что делает его бесценным методом для изучения живых клеток11,12. Этот метод визуализации оказался незаменимым в изучении клеточной динамики, особенно при метаболических заболеваниях и раке, где точные молекулярныевзаимодействия имеют решающее значение. FRET также позволяет в режиме реального времени отслеживать молекулярные взаимодействия, проливая свет на такие механизмы, как резистентность к инсулину и прогрессирование опухоли14,15. Биосенсоры FRET имеют решающее значение в исследованиях рака, изучая микроокружение опухоли, устойчивость к лекарствам и метаболические нарушения16. Методы детектирования FRET, такие как сенсибилизированная эмиссия (SE), акцепторное обесцвечивание (AB), флуоресцентная микроскопия в течение жизни (FLIM) и спектроскопия, имеют явные преимущества для количественной оценкимолекулярных взаимодействий. SE измеряет передачу энергии между донорными и акцепторными флуорофорами, что приводит к измеряемому сдвигу в спектрах излучения, который коррелирует с близостью взаимодействующих биомолекул18. AB использует селективное фотообесцвечивание акцепторного флуорофора и отслеживает изменения донорной флуоресценции, что позволяет исследователям оценить кинетику взаимодействия и расстояния19. FLIM оценивает скорость распада флуоресценции донорного флуорофора, на которую непосредственно влияет эффективность FRET, чтобы обеспечить точные наноразмерные измерения молекулярных взаимодействий20.

Используя методы FRET, мы недавно продемонстрировали бистабильные ответы инсулина в миотрубках, полученных из C2C12 8,9,21,22,23,24. Как мы обнаружили, различные пороги включения и выключения активации Akt позволяют предположить, что градуированная доза-реакция всего организма на инсулин противоречит сложности субклеточного сигнального каскада, начинающегося от инсулинового стимула, который достигает кульминации в ответе «все или ничего» на уровне отдельных клеток 21,22,23,24. Чтобы проверить наличие бистабильности в других типах клеток, мы стимулировали клетки HepG2 инсулином и регистрировали их реакцию с помощью одноклеточной FRET-визуализации. Мы стимулировали клетки HepG2 с различной концентрацией инсулина и контролировали активность Akt на уровне отдельных клеток с помощью биосенсора Akt. Биосенсор Akt содержит усиленный голубой флуоресцентный белок (ECFP)25 в качестве донора флуорофора и самый яркий вариант желтого флуоресцентного белка (YPet)26 в качестве акцепторного флуорофора, связанного линкером Eevee, содержащим пептидную последовательность SGRPRTTTFADSCKP. Этот пептид выступает в качестве субстрата для фосфорилированного Akt (pAkt), оптимизированного из киназы гликогенсинтазы человека 3β (GSK3β). В нефосфорилированном состоянии пространственное расстояние между донорным и акцепторным флуорофорами превышает радиус Фёрстера, что препятствует передаче энергии. При стимуляции инсулином происходит фосфорилирование Akt, которое приводит к фосфорилированию SGRPRTTTFADSCKP. Этот процесс вызывает конформационное изменение, в результате которого донор и акцептор попадают в радиус Фёрстера, что позволяет проводить FRET27. В результате интенсивность сигнала FRET коррелирует с количеством фосфорилированных молекул Akt и позволяет количественно оценить инсулин-опосредованные клеточные реакции в режиме реального времени.

Этот протокол, первоначально разработанный для изучения передачи сигналов инсулина в миотрубках, полученных из C2C12, был успешно применен к клеткам HepG2 и использован на различных аппаратных и программных платформах, тем самым продемонстрировав его применимость, адаптивность и универсальность. Клетки HepG2 проявляют конститутивную активность Akt, что делает их идеальной моделью in vitro для изучения специфической для печени передачи сигналов инсулина и метаболических процессов. Ключевые особенности протокола пошагово описаны в разделе протокола.

протокол

Обзор экспериментальных этапов визуализации живых клеток FRET для мониторинга фосфорилирования Akt в одиночных клетках HepG2 показан на рисунке 1.

1. Получение, размножение и очистка плазмид

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описаны основные шаги по получению, амплификации и очистке плазмиды, необходимой для анализа FRET одиночных клеток.

  1. Используйте плазмиду pEevee-iAkt-NES-YPet (рис. 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида была любезно предоставлена профессором Казухиро Аоки из Национального института фундаментальной биологии (NIBB), Япония.Плазмидные карты для биосенсоров FRET, используемых для мониторинга Akt, и их соответствующих элементов управления изображены на рисунке 2. pEevee-iAkt-NES-ECFP (донор; Рисунок 2В) и pEevee-iAkt-NES-Ypet (акцептор; Рисунок 2В) плазмиды используются в качестве калибровочных контрольных во время экспериментов FRET9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показан состав и механизм работы внутримолекулярного биосенсора FRET.
  2. Чтобы размножить плазмиду, проведите бактериальную трансформацию с использованием химически компетентных клеток E. coli (см. Таблицу материалов). Трансформированные клетки помещают на агар Лурии-Бертани (LB), содержащий ампициллин 100 мкг/мл, и инкубируют в течение ночи при 37 °C. На следующий день выберите устойчивую к ампициллину колонию и культивируйте ее в бульоне LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина для амплификации плазмид.
  3. Для очистки плазмидной ДНК используйте коммерчески доступный набор для очистки плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов) для получения высокой чистоты и выхода. Оцените качество ДНК путем измерения коэффициентов поглощения (A260/A280 и A260/A230) с помощью спектрофотометра (см. Таблицу материалов). Оптимальными считаются соотношения от 1,8-2,0 до 2,0-2,2. Проверьте целостность плазмиды с помощью электрофореза в агарозном геле, чтобы убедиться, что она пригодна для трансфекции.

2. Процедура культивирования клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры культивирования клеток в ламинарном колпаке для поддержания стерильной среды и предотвращения загрязнения. Рабочий процесс культивирования клеток HepG2 показан на рисунке 4. Полная среда для клеток HepG2 состоит из минимально незаменимой среды (MEM), 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% заменимых аминокислот (NEAA), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ добавки L-глютамина, 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина и 2,5 мкг/мл антибиотико-антимикотического раствора (см. Таблицу материалов, Таблицу 1).

  1. Быстро разморозьте замороженные клетки HepG2, поместив флакон в термомиксер с температурой 37 °C или водяную баню до полного оттаивания.
  2. Перенесите размороженные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл полной питательной среды (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием предварительно нагрейте всю питательную среду до 37 °C, чтобы свести к минимуму тепловой удар клеток.
  3. Центрифугируйте пробирку при давлении 200 x g в течение 5 минут, чтобы гранулировать клетки.
  4. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость с помощью наконечника пипетки с широким отверстием, чтобы не повредить клеточную гранулу.
  5. Ресуспендируйте гранулу в 10 мл свежей полной питательной среды.
  6. Перенесите клеточную суспензию в колбу для культуры тканей размером 75 см².
  7. Инкубируйте колбу при температуре 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за клетками в течение следующих 24-48 часов, чтобы подтвердить прикрепление и оценить выздоровление. Перед сменой среды не тревожьте клетки в течение как минимум 4 часов, чтобы обеспечить правильное крепление. Избегайте частого открывания инкубатора в течение первых 4 часов, так как это может нарушить прикрепление клеток. Соблюдайте институциональные протоколы биобезопасности и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) для поддержания безопасной рабочей среды во время всех процедур культивирования клеток. Субкультуральные клетки HepG2, когда они достигают 70%-80% конфлюенции для поддержания оптимальных условий роста и предотвращения перенаселенности, что может повлиять на жизнеспособность клеток и потенциал роста.
  8. Для субкультивирования аспирируйте среду и однократно промойте клетки 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  9. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина, чтобы покрыть монослой клеток (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что трипсин предварительно подогрет до 37 °C для оптимальной активности. Не стоит чрезмерно трипсинизировать клетки, так как это может снизить жизнеспособность. Наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить отслойку.
  10. Выдерживать при температуре 37 °C около 5 минут.
  11. Когда клетки отделятся, добавьте 2 мл готовой среды для нейтрализации трипсина и соберите клетки с помощью пипетирования.
  12. Аккуратно пипетируйте клеточную суспензию, чтобы разбить комки и получить одноклеточную суспензию.
  13. Добавьте 3 мл готовой среды в каждую новую колбу, затем перенесите ячейки в соотношении 1:2 в каждую колбу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ранних отрывков разделите ячейки в соотношении 1:2. После отрывков 4-5 можно проводить разбавления в соотношении 1:4 или 1:5, если это уместно.
  14. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте клетки через 24 часа, чтобы подтвердить прикрепление и оценить выздоровление.
  15. Для рутинного посева заменяйте питательную среду каждые 2-3 дня или чаще, если показатель pH меняется с розового на желтый, что указывает на закисление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте, чтобы среда стала слишком кислой, так как это может нанести вред клеткам.
  16. Регулярно проверяйте морфологию клеток под микроскопом, чтобы убедиться в их здоровье.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для кратковременного хранения заморозьте клетки HepG2 при температуре -80 °C; При длительном хранении хранить в жидком азоте. Состав замораживающей среды, использованной в данном эксперименте, приведен в таблице 2.

3. Покрытие посуды для визуализации поли-l-лизином

  1. Используйте 1 мл 0,1 мг/мл раствора поли-L-лизина на каждый планшет для визуализации, чтобы покрыть всю поверхность (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию поли-L-лизина в зависимости от требований к конкретному типу клеток.
  2. Осторожно покачивайте чашку, чтобы добиться равномерного покрытия поверхности культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте стерильные условия на протяжении всего процесса, чтобы предотвратить загрязнение.
  3. Инкубируйте посуду в течение ночи при комнатной температуре (RT).
  4. Аспирируйте избыток раствора поли-L-лизина из посуды путем дозирования.
  5. Промойте поверхность PBS три раза, отдыхая каждый раз в течение 5 минут (см. Таблицу материалов). Полностью удалите несвязанный поли-L-лизин из чашки для визуализации, чтобы предотвратить ингибирование роста клеток. Осторожно промойте пластины, чтобы не поцарапать или не повредить стеклянное дно.
  6. Высушите чашки с покрытием при температуре 37 °C на воздухе в течение не менее 3 часов.
  7. Используйте посуду с покрытием для визуализации сразу или храните ее при температуре 4 °C до 2 недель.

4. Трансфекция клеток HepG2

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод трансфекции HepG2 показан на рисунке 5.

  1. Засейте клетки HepG2 в предварительно покрытых чашках для визуализации за 24-48 ч до трансфекции, чтобы убедиться, что они достигают 70%-90% слияния.
  2. Разморозьте на льду трансфекционный реагент и плазмиду, кодирующую биосенсор FRET. Тщательно окунитесь в вихрь и выполните короткий отжим (например, 5 000 x g в течение 5 с) перед использованием (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием убедитесь, что реагент для трансфекции и плазмида полностью разморожены.
    ВНИМАНИЕ: Избегайте повторных циклов замораживания-размораживания, так как это может снизить эффективность реагента для трансфекции.
  3. Добавьте 8 мкг плазмиды, кодирующей биосенсор FRET, с реакционным буфером до конечного объема 100 мкл. Хорошо перемешайте путем вортексирования в течение 5 с с высокой скоростью (примерно 3000-5000 х г).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда добавляйте плазмиду в буфер перед добавлением реагента для трансфекции на основе полимера. Не менее 50 мкл раствора должно состоять из реакционного буфера (см. Таблицу материалов).
  4. Добавьте 2,4 мкл трансфекционного полимера в пробирку, содержащую разбавленную плазмидную ДНК. Хорошо перемешайте путем вортексирования в течение 15 с на высокой скорости (примерно 3 000-5 000 × г).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте 0,3 мкл трансфекционного полимера на 1 мкг ДНК.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что трансфекционный полимер тщательно перемешан с плазмидной ДНК для образования однородных комплексов наночастиц.
  5. Инкубируйте смесь биосенсора и полимера при температуре 37 °C в течение 15 минут, чтобы образовались комплексы наночастиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте хранения полимера для трансфекции в растворе более 30 минут, так как это может снизить эффективность трансфекции.
    ВНИМАНИЕ: Внимательно следите за временем инкубации, чтобы предотвратить чрезмерную инкубацию, которая может привести к снижению эффективности трансфекции.
  6. Поверните пробирку вниз в течение 5 с при 5000 x g, чтобы собрать содержимое на дне, затем добавьте весь 100 мкл раствора комплекса наночастиц по каплям в среду для культивирования клеток. Аккуратно покачивайте тарелку вперед и назад, чтобы перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор комплекса наночастиц добавлен по каплям, чтобы равномерно распределить его по среде клеточной культуры.
    ВНИМАНИЕ: Избегайте энергичных раскачиваний, так как это может привести к смещению клеток или неравномерному распределению комплексов.
  7. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C от 4 часов до ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может быть скорректировано в зависимости от экспериментальных потребностей, но обычно достаточно 4 часов для эффективной трансфекции.
    ВНИМАНИЕ: Избегайте длительной инкубации (>16 ч), так как это может снизить жизнеспособность клеток.
  8. Удалите комплексы наночастиц из клеток путем аспирации, замените их 2 мл свежей полной питательной среды и верните планшет в инкубатор при температуре 37 °C до момента проведения анализа. Пик экспрессии обычно достигает 48 ч после трансфекции.
  9. Анализируйте клетки с помощью флуоресцентной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что микроскоп правильно откалиброван для флуоресцентной визуализации, чтобы получить точные результаты.
    ВНИМАНИЕ: Сведите к минимуму воздействие интенсивного света на клетки во время визуализации, чтобы предотвратить фототоксичность.

5. Голодание клеток HepG2

ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения этапа трансфекции заморочьте клетки сывороткой перед стимуляцией инсулином и визуализацией FRET. Это сводит к минимуму активацию пути Akt из-за инсулина, присутствующего в FBS, и обеспечивает стабильный исходный уровень активности Akt. Состав среды для голодания, использованной в данном эксперименте, описан в таблице 3. BSA выпускается в порошкообразной форме. Чтобы приготовить 0,1% (мас./об.) раствор, восстановите 0,1 г BSA в 3 мл DMEM, тщательно перемешав. Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,45 мкм и отрегулируйте конечный объем до 100 мл путем добавления DMEM.

  1. Удалите питательную среду и промойте чашки для визуализации 1x PBS дважды в течение 5 минут каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два промывания PBS помогают полностью удалить остатки сыворотки и любой инсулин или факторы роста, которые могут помешать эксперименту.
  2. Добавьте 2 мл среды для голодания в чашки для визуализации (см. Таблицу материалов). Аккуратно добавьте среду по краю посуды, чтобы избежать смещения ячеек со стеклянного дна. Выдерживать при 37 °C в течение 4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 4-часовая инкубация является оптимальной для синхронизации клеточного метаболизма; Однако продолжительность может быть увеличена в зависимости от экспериментальных потребностей.

6. FRET визуализация живых клеток для клеток HepG2

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены инструкции по визуализации живых клеток FRET для мониторинга пространственно-временной динамики фосфорилирования Akt в одиночных клетках HepG2. Важно оптимизировать настройку микроскопа, процедуры работы и условия визуализации живых клеток HepG2, как описано ниже. Настройка микроскопа имеет решающее значение для оптимизации условий визуализации при FRET-визуализации. Для обеспечения стабильной работы выполните пошаговую настройку ПК/конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) в соответствии с инструкциями производителя. Настраиваемая конфигурация CLSM для визуализации FRET показана на рисунке (Рисунок 6).

  1. Включите дистанционный переключатель для питания микроскопа, компьютера, сканера, запуска лазера, пьезостолика и эпифлуоресцентного светодиодного источника света. Перед включением убедитесь, что все компоненты правильно подключены, чтобы избежать возможных повреждений.
  2. Поверните ключ в положение ON на запуске лазера и нажмите кнопки для активации обоих лазеров, необходимых для FRET (лазерные линии 457 нм и 514 нм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что установлены соответствующие фильтры и настройки для оптимального создания образа ладов. Выбор лазерной линии должен основываться на профилях возбуждения и излучения биосенсора.
  3. Включите удлинитель для питания компьютера и монитора, подключенных к микроскопу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед включением убедитесь, что все соединения надежны, чтобы предотвратить повреждение оборудования.
  4. Войдите в Windows и запустите программное обеспечение для микроскопии.
  5. Нажмите A1 для захвата, чтобы начать настройку изображения. Выберите подходящие оптические конфигурации в соответствии с требованиями эксперимента FRET.
  6. При необходимости отрегулируйте мощность лазера и чувствительность детектора для достижения оптимальных условий визуализации. Аккуратно установите микроскоп на столик верхнего инкубатора и закрепите его винтами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивайте винты слишком сильно, чтобы не повредить инкубатор или предметный столик микроскопа.
  7. Наполните внутреннюю водяную баню стерильной водой двойной дистилляции (ddH2O). Надежно установите верхний нагреватель и включите источник питания для нагревателя сцены, нагревателя ванны и обогревателя линз (рис. 7A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не переливайте во избежание попадания в систему. Убедитесь, что все нагреватели работают должным образом, чтобы поддерживать постоянный температурный режим для визуализации живых клеток.
  8. Для получения изображения используйте 40-кратный масляный иммерсивный объектив (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Технические характеристики см. на веб-сайте производителя.
  9. Протрите линзу объектива бумагой для линз, смоченной на 95% этанолом. Нанесите небольшую каплю иммерсионного масла на линзу объектива (рисунок 7B). Поместите чашку для визуализации, содержащую клетки HepG2, на предметный столик микроскопа и закрепите ее держателем (рис. 7C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что чашка для визуализации правильно выровнена и закреплена, чтобы предотвратить любое движение во время визуализации. Избегайте давления на линзу, чтобы не повредить как линзу, так и стеклянное дно посуды.
  10. Закройте камеру и инкубируйте клетки в камере живых клеток в течение 1-2 часов, чтобы они могли сбалансироваться (рисунок 7D).
  11. Во время цейтраферной визуализации сделайте паузу через определенные промежутки времени и аккуратно удалите среду (рис. 7E), затем добавьте 1 мл свежеприготовленной среды с заданной концентрацией инсулина (рис. 7F, таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте стоковый раствор инсулина в дозе 1 мг/мл, растворив 1 мг инсулина в 1 мл 10 мМ уксусной кислоты. Отфильтруйте раствор через стерильный шприцевой фильтр 0,2 мкм и храните аликвоты при температуре −20 °C.
  12. Откройте окно «Захват ND» в меню «Файл » программного обеспечения для микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка сбора данных ND показана на рисунке 8.
  13. Выберите вкладку Время , чтобы задать интервал, продолжительность и желаемые циклы для цейтраферной съемки. Затем перейдите на вкладку XY и нажмите кнопку + добавить , чтобы включить отдельные клетки HepG2 для визуализации.
  14. Чтобы добавить несколько ячеек, найдите подходящие ячейки, выполните сканирование, выполните тонкую настройку фокусировки и заблокируйте функцию расширения точки (PSF). Повторяйте этот шаг для каждой новой ячейки, добавленной для визуализации. Сканируйте несколько клеток в разных местах на чашках визуализации, чтобы определить различные клетки-мишени для включения.
  15. Нажмите на красный значок X, чтобы отменить выбор ячеек. Установите флажок «Z», чтобы установить положение Z. Выбрав все параметры, введите название эксперимента в поле «Имя файла».
  16. Нажмите «Обзор», чтобы выбрать папку назначения, затем установите флажок «Сохранить в файл». Нажмите на вкладку «Запустить сейчас», чтобы начать сбор ND. В окне сбора данных ND будет отображаться ход выполнения покадровой съемки в режиме реального времени, включая прошедшее и оставшееся время.
  17. Запись исходных измерений в течение 30 минут без стимуляции клеток инсулином.
  18. Найдите подходящие ячейки, увеличьте или увеличьте масштаб, чтобы сфокусировать одну ячейку, и выберите ячейки с высокой интенсивностью флуоресценции. Добавляйте ячейки по одной, максимум до 6 ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте количество ячеек, чтобы предотвратить задержки при получении изображения и зависание окна во время визуализации.
  19. Установите время и частоту визуализации для цейтраферной съемки. Запустите интервальную съемку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом сеанса визуализации убедитесь, что все параметры, включая время экспозиции и мощность лазера, оптимизированы.
  20. Сделайте паузу в визуализации через равные промежутки времени, аккуратно удалите среду из чашки со стеклянным дном и добавьте 1 мл среды, дополненной инсулином соответствующей концентрации.
  21. Продолжите получение изображения. При необходимости повторите шаг 6.20.
  22. В конце эксперимента щелкните вкладку Готово, чтобы закрыть. Безопасное резервное копирование и хранение полученных изображений для анализа.

7. Анализ данных

  1. Корректируйте предварительно обработанные данные покадровой визуализации FRET из контрольных образцов на предмет спектральных перекрестных помех и автофлуоресценции CFP, что приводит к корректировке значений FRET и точной эффективности FRET. Используйте программное обеспечение для визуализации для получения, обработки и анализа изображений FRET, следуя протоколам, изложенным в предыдущих исследованиях 27,28,29,30 (рис. 9).

8. Расчет эффективности FRET

  1. Чтобы определить эффективность FRET, получите семь изображений: ячейки (IDA(D), IDD(D), IDA(A), IAA(A), IDD, IAA и IDA). Рассчитайте эффективность FRET по следующей формуле:
    figure-protocol-20888
    где FRETCorrected получается из уравнения:
    figure-protocol-21048
    где d и a определяются как:
    figure-protocol-21191
    figure-protocol-21285
    Здесь IDA, IDD и IAA представляют изображения клеток, трансфицированных с помощью биосенсора. IDA(D)  и IDD(D)) — контрольные изображения только для донора, а IDA(A) и IAA(A) — только для акцепторных контрольных изображений.

9. Получение изображения

  1. IDA : Получение изображения путем донорского возбуждения (434 нм) с акцепторным излучением (530 нм).
  2. IDD : Получение изображения путем донорного возбуждения (434 нм) с донорским излучением (477 нм).
  3. IAA : Получение изображения путем возбуждения акцептора (517 нм) с излучением акцептора (530 нм).
  4. IDA(D) и IDA(A) : Получение изображения с использованием того же возбуждения и излучения, что и IDA, но от клеток, экспрессирующих только донора и акцептора соответственно.
  5. IDD(D) : Получить изображение в тех же условиях, что и IDD для управления только донором.
  6. IAA(A) : Получить изображение с использованием тех же условий, что и IAA, но специфично для элемента управления только акцептором.

10. Коррекция фона

  1. Откройте программу для анализа изображений на компьютере. В верхней строке меню откройте меню «Файл ». Выберите « Открыть» или «Открыть файл » в раскрывающемся списке.
  2. Перейдите в каталог, содержащий данные покадрового изображения. Найдите цейтраферное изображение, которое требует анализа (например, формат nd2).
  3. Выберите файл и нажмите кнопку «Открыть » или «ОК», чтобы загрузить его в программу для просмотра и анализа. Определите область интереса (ROI) в ячейке (или используйте всю ячейку в качестве ROI) и запишите значение серого для каждого пикселя в этой области.
  4. Выберите в качестве фона свободную от ячеек область и рассчитайте ее среднее значение серого. Создайте скорректированное изображение, вычтя это среднее значение фона из значения серого каждого пикселя в пределах ROI ячейки.

11. Устранение сквозных помех (перекрестных помех) FRET

ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральное перекрытие между излучением донора и возбуждением акцептора показано на рисунке 3B, что имеет решающее значение для эффективности FRET и процесса передачи энергии. Просвечивание при покадровой визуализации FRET является серьезной проблемой, возникающей из-за спектрального перекрытия донорных и акцепторных флуорофоров, что приводит к неточным измерениям. Перекрестные помехи являются врожденными, потому что спектры как донорных, так и акцепторных флуорофоров в некоторой степени перекрываются (рис. 3C, D). Эта проблема усугубляется такими факторами, как высокая концентрация флуорофоров и неправильная конфигурация фильтров. Решение проблемы просачивания имеет решающее значение для обеспечения надежности измерений FRET.

  1. Обратитесь к предыдущему исследованию для получения информации о методе смягчения эффектов просвечивания9.

12. Количественная оценка и статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью программного обеспечения для статистического анализа.

Результаты

Для исследования активации Akt в клетках HepG2 клетки были помещены на предварительно покрытые чашки для визуализации и трансфицированы с помощью биосенсора pEevee-iAkt-NES на основе FRET (рис. 2A), разработанного для обеспечения мониторинга фосфорилирования Akt в р...

Обсуждение

Протокол визуализации FRET живых клеток для мониторинга фосфорилирования Akt в клетках HepG2 включает в себя несколько ключевых этапов для обеспечения надежных и воспроизводимых результатов. Первым важным этапом является культивирование клеток, которое включает в себя р...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук Шэньчжэня (JCYJ20240813113606009), Шэньчжэньско-гонконгской зоной сотрудничества в области технологий и инноваций (HZQB-KCZYB-2020056), Национальным фондом естественных наук Китая (32070681), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2019YFA0906002) и Шэньчжэньским планом павлина (KQTD2016053117035204).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibcoCat#25200-056Use ice-cold PBS for cell wash
15 mm glass bottom cell culture dishNESTCat#801001
2 mL Nalgene cryogenic vialsThermo ScientificCat#5012-0020
5 mL Stripette Serological PipetsCorningCat#4487
95% EthanolKermelCat#C028005
A1 HD25/A1R HD25 confocal microscopeNikonhttps://www.nikon.com/Magnification: 40×, Numerical Aperture (NA): 1.30, Pixel Dwell Time: 2.4 ms, Pixel Size: 1024
AmpicillinSigma-AldrichCat#A9393
Bovine serum albumin (BSA)VWR Life ScienceCat#N208-10g
Corning 25 cm2 rectangular culture flasksCorningCat#430639
Countess 3 automated cell counterThermo Scientifichttp://www.thermofisher.com/#AMQAX2000
Countess cell counting chamber slidesThermo Scientifichttp://www.thermofisher.com/#C10228
Digital vortex mixersThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichCat#D2650
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorfCat#022363204
EZ-PCR mycoplasma detection kitBiological IndustriesCat# 20-700-20
Fetal Bovine Serum, qualified, AustraliaGibcoCat#10099141
GlutaMAX SupplementGibcoCat#35050061
GraphPad Prism 9GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/
HepG2National Collection of Authenticated Cell Cultures#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510  http://www.cellbank.org.cn/
Immersion Oil Type 37Cargille LaboratoriesCat #16237
InsulinSigma-AldrichCat#I5500-50MGWarm to 37 °C before use
LB Broth (1x)InvitrogenCat#10855001
Minimum Essential Medium (MEM)GibcoCat#11095080Warm to 37 °C before use
mySPIN 12 mini centrifugeThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
NanoDrop OneThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com
Nikon Plan Fluor 40×/1.30 Oil LensNikonhttps://www.nikon.com/
NIS-Elements-ARNikonhttps://www.nikon.com/
Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x)GibcoCat#11140050
One Shot LB Agar Plates InvitrogenCat#A55802
One Shot Stbl3 chemically competent E. coliInvitrogenCat#C737303
ParafilmPARAFILMCat#B8R05606
PBS (phosphate buffered saline)GibcoCat#10010023
pEevee-iAkt-NES (7,033 bp)Miura et al31https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit
Penicillin-streptomycinGibcoCat#15070063
Plasmocin prophylacticInvivoGenCat#ant-mpp
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-AldrichCat#P4832
Precision general purpose bathsThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
QIAprep spin miniprep kitQIAGENCat#27106
SnapGeneSnapGene by Dotmaticshttps://www.snapgene.com
Sodium Pyruvate (100 mM)GibcoCat#11360070
Syringe filter unit, 0.22 μmMilliporeCat#SLGP033RS
Tokai Hit stage top incubatorTOKAI HIThttps://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator
UltraPure DNase/RNase-free distilled waterInvitrogenCat#10977015
Xfect Transfection ReagentTakara BioCat#631317

Ссылки

  1. GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
  2. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216 (2022).
  3. Poloz, Y., Stambolic, V. Obesity and cancer, a case for insulin signaling. Cell Death Dis. 6 (12), e2037 (2015).
  4. Arcidiacono, B., et al. Insulin resistance and cancer risk: an overview of the pathogenetic mechanisms. Exp Diabetes Res. 2012, 789174 (2012).
  5. Godsland, I. F. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in the development and progression of cancer. Clin Sci (Lond). 118 (5), 315-332 (2009).
  6. Tsugane, S., Inoue, M. Insulin resistance and cancer: epidemiological evidence. Cancer Sci. 101 (5), 1073-1079 (2010).
  7. Yudhani, R. D., et al. In vitro insulin resistance model: A recent update. J Obes. 2023, 1964732 (2023).
  8. Akhtar, J., et al. Bistable insulin response: The win-win solution for glycemic control. iScience. 25 (12), 105561 (2022).
  9. Akhtar, J., Imran, M., Wang, G. Protocol for live-cell Forster resonance energy transfer imaging to reveal the bistable insulin response of single C2C12-derived myotubes. STAR Protoc. 5 (2), 103109 (2024).
  10. Kamino, K., et al. Optimal inference of molecular interaction dynamics in FRET microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), e2211807120 (2023).
  11. Kraft, A. E., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time visualization of second messengers in living cells. Methods Mol Biol. 1563, 85-90 (2017).
  12. Veeriah, S., et al. High-throughput time-resolved FRET reveals Akt/PKB activation as a poor prognostic marker in breast cancer. Cancer Res. 74 (18), 4983-4995 (2014).
  13. Conway, J. R. W., et al. Monitoring AKT activity and targeting in live tissue and disease contexts using a real-time Akt-FRET biosensor mouse. Sci Adv. 9 (17), eadf9063 (2023).
  14. Chandris, P., Giannouli, C. C., Panayotou, G. Imaging approaches for the study of metabolism in real time using genetically encoded reporters. Front Cell Dev Biol. 9, 725114 (2021).
  15. Yang, J., et al. Longitudinal FRET imaging of glucose and lactate dynamics and response to therapy in breast cancer cells. Mol Imaging Biol. 24 (1), 144-155 (2022).
  16. Mandrou, E., et al. A reliable system for quantitative G-protein activation imaging in cancer cells. Cells. 13 (13), 1114 (2024).
  17. Fang, C., Huang, Y., Zhao, Y. Review of FRET biosensing and its application in biomolecular detection. Am J Transl Res. 15 (2), 694-709 (2023).
  18. Miller, J. N. Fluorescence energy transfer methods in bioanalysis. Analyst. 130 (3), 265-270 (2005).
  19. Verveer, P. J., Rocks, O., Harpur, A. G., Bastiaens, P. I. Imaging protein interactions by FRET microscopy: FRET measurements by acceptor photobleaching. CSH Protoc. 2006 (6), (2006).
  20. Vu, C. Q., Arai, S. Quantitative imaging of genetically encoded fluorescence lifetime biosensors. Biosensors (Basel). 13 (10), 939 (2023).
  21. Wang, G. A more holistic view of the logarithmic dose-response curve offers greater insights into insulin response. J Biol Chem. 301 (1), 108037 (2025).
  22. Wang, G. Body mass dynamics is determined by the metabolic Ohm's law and adipocyte-autonomous fat mass homeostasis. iScience. 23 (6), 101176 (2020).
  23. Wang, G. Raison d'être of insulin resistance: the adjustable threshold hypothesis. J R Soc Interface. 11 (101), 20140892 (2014).
  24. Wang, G. Optimal homeostasis necessitates bistable control. J R Soc Interface. 9, 2723 (2012).
  25. Heim, R., Tsien, R. Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6 (2), 178-182 (1996).
  26. Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
  27. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nat Protoc. 8 (2), 265-281 (2013).
  28. Gordon, G. W., Berry, G., Liang, X. H., Levine, B., Herman, B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J. 74 (5), 2702-2713 (1998).
  29. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophys J. 45 (5), 939-946 (1984).
  30. Youvan, D. C., et al. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy. , (2002).
  31. Miura, H., Matsuda, M., Aoki, K. Development of a FRET biosensor with high specificity for Akt. Cell Struct Funct. 39 (1), 9-20 (2014).
  32. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
  33. Rani, K., Sengupta, S. Multi-stimuli programmable FRET based RGB absorbing antennae towards ratiometric temperature, pH and multiple metal ion sensing. Chem Sci. 12 (47), 15533-15542 (2021).
  34. Betolngar, D. B., et al. pH sensitivity of FRET reporters based on cyan and yellow fluorescent proteins. Anal Bioanal Chem. 407 (14), 4183-4193 (2015).
  35. Salonikidis, P. S., et al. An ion-insensitive cAMP biosensor for long term quantitative ratiometric fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements under variable physiological conditions. J Biol Chem. 286 (26), 23419-23431 (2011).
  36. Youvan, D. C., et al. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy using genetically engineered GFP derivatives on nickel chelating beads. Biotechnol Alia. 3, 1-18 (1997).
  37. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry A. 99 (4), 407-416 (2021).
  38. Batta, A., Hajdu, T., Nagy, P. Improved estimation of the ratio of detection efficiencies of excited acceptors and donors for FRET measurements. Cytometry A. 103 (7), 563-574 (2023).
  39. Coullomb, A., et al. QuanTI-FRET: a framework for quantitative FRET measurements in living cells. Sci Rep. 10 (1), 6504 (2020).
  40. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  41. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophys J. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  42. Hochreiter, B., Kunze, M., Moser, B., Schmid, J. A. Advanced FRET normalization allows quantitative analysis of protein interactions including stoichiometries and relative affinities in living cells. Sci Rep. 9 (1), 8233 (2019).
  43. Liu, H., Zhang, F., Mishra, S. K., Zhou, S., Zheng, J. Knowledge-guided fuzzy logic modeling to infer cellular signaling networks from proteomic data. Sci Rep. 6, 35652 (2016).
  44. Garrido-Rodriguez, M., Zirngibl, K., Ivanova, O., Lobentanzer, S., Saez-Rodriguez, J. Integrating knowledge and omics to decipher mechanisms via large-scale models of signaling networks. Mol Syst Biol. 18 (7), e11036 (2022).
  45. Greenwald, E. C., Polanowska-Grabowska, R. K., Saucerman, J. J. Integrating fluorescent biosensor data using computational models. Methods Mol Biol. 1071, 227-248 (2014).
  46. Zhao, Z., Xia, J. Computational Approaches for Modeling Signal Transduction Networks. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology. , (2019).
  47. Wang, G., Krueger, G. R. Computational analysis of mTOR signaling pathway: bifurcation, carcinogenesis, and drug discovery. Anticancer Res. 30 (7), 2683-2688 (2010).
  48. Wang, G. Singularity analysis of the AKT signaling pathway reveals connections between cancer and metabolic diseases. Phys Biol. 7 (4), 046015 (2010).
  49. Chedere, A., Hari, K., Kumar, S., Rangarajan, A., Jolly, M. K. Multi-stability and consequent phenotypic plasticity in AMPK-Akt double negative feedback loop in cancer cells. J Clin Med. 10 (3), 472 (2021).
  50. Mosca, E., et al. Computational modeling of the metabolic States regulated by the kinase akt. Front Physiol. 3, 418 (2012).
  51. Liao, J., Madahar, V., Dang, R., Jiang, L. Quantitative FRET (qFRET) technology for the determination of protein-protein interaction affinity in solution. Molecules. 26 (21), 6339 (2021).
  52. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: Principle applications recent advances and challenges. Diagnostics (Basel). 13 (8), 1375 (2023).
  53. Mattheisen, J. M., et al. Application of bioluminescence resonance energy transfer to quantitate cell-surface expression of membrane proteins. Anal Biochem. 684, 115361 (2024).
  54. Lionetti, M. C., La Porta, C. A. M. FLIM-FRET investigation of heterogeneous huntingtin aggregation in HeLa cells. Methods Mol Biol. 2551, 595-604 (2023).
  55. Petutschnig, E. K., Pierdzig, L., Mittendorf, J., Niebisch, J. M., Lipka, V. A novel fluorescent protein pair facilitates FLIM-FRET analysis of plant immune receptor interaction under native conditions. J Exp Bot. 75 (3), 746-759 (2024).
  56. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Gotz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. J Vis Exp. 66, e4081 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены