Для начала возьмите одну аликвоту объемом 75 микролитров, содержащую один миллиграмм магнитных шариков, покрытых стрептавидином, связанных с ДНК, и удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки. Промойте шарики с 200 микролитрами загрузочного буфера. Затем повторно суспендируйте шарики в 75 микролитрах загрузочного буфера и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.
Затем добавьте к связанной с гранулами ДНК комплекс распознавания происхождения в конечной концентрации 37,5 наномоляров и инкубируйте реакцию в течение пяти минут при температуре 30 градусов Цельсия с перемешиванием 800 оборотов в минуту. Добавьте CDC6 в конечной концентрации 50 наномоляров и инкубируйте реакцию, как было показано ранее. Затем добавьте Mcm2-7 Cdt1 в конечной концентрации 100 наномоляров и инкубируйте реакцию в течение 20 минут, как было показано ранее.
После этого добавьте ДДК в конечной концентрации 100 наномоляров и аналогично инкубируйте в течение 30 минут. После удаления надосадочной жидкости промойте связанную с гранулами ДНК, содержащую фосфорилированные гексамеры Mcm-2-7, 200 микролитрами буфера для промывки с высоким содержанием солей. Перемешайте с помощью пипетки, убедившись, что шарики полностью суспендированы.
Далее снимите буфер и промойте шарики один раз 200 микролитрами буфера CMG. Чтобы собрать и активировать флуоресцентно меченый CMG на связанной с гранулами ДНК, удалите буфер CMG и повторно суспендируйте связанные с ДНК гранулы в 50 микролитрах буфера CMG с добавлением пяти миллимолярных ADP. Далее смешайте все упомянутые на сите компоненты в одной трубке и поместите ее на лед.
Немедленно добавьте ресуспендированную ДНК, связанную с шариками, в белковую смесь. Инкубируйте реакцию в течение 15 минут при температуре 30 градусов Цельсия при перемешивании со скоростью 800 об/мин. Последовательно промойте валик буфером HSW и буфером CMG.
После удаления буфера повторно суспендируйте CMG, содержащую связанные с ДНК магнитные шарики, в 200 микролитрах элюирующего буфера, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа при перемешивании со скоростью 800 об/мин. Поместите трубку в магнитную решетку и дайте набрать бусины в течение пяти минут. Осторожно соберите надосадочную жидкость, содержащую элюированные комплексы ДНК-КМГ, не нарушая осевших шариков, и перенесите ее в новую пробирку.
Чтобы в растворе не осталось шариков, снова поместите собранную надосадочную жидкость в магнитный штатив и тщательно подержите еще пять минут. Соберите надосадочную жидкость и переложите ее в новую трубку. Добавьте 1 400 микролитров буфера CMG к 200 микролитрам надосадочной жидкости.
Теперь образец готов к визуализации отдельных молекул.
