Выполняйте визуализацию отдельных молекул в коммерческой установке, сочетая двухлучевой оптический пинцет с конфокальной микроскопией. Используйте первый канал для инъекций, второй канал для связывания белковых комплексов ДНК, третий канал для проверки наличия CMG, а четвертый и пятый каналы в качестве резервуаров белка и мест обмена буфером. Подайте все растворы в проточную ячейку при постоянном давлении 0,5 бар в отверстии впрыска.
Затем выключите подачу в четвертом и пятом каналах. После первоначальной подачи всех растворов уменьшите давление до 0,2 бар. Перемещайте захватывающие лазеры так, чтобы направить один из них, пока одна бусина не попадет в каждую оптическую ловушку.
Переместите захваченные бусины на второй канал, перемещая джойстик во время нажатия на спусковой крючок. С помощью джойстика без нажатия на спусковой крючок вы создаете комплекс ДНК CMG, перемещая правую бусину к левой бусине и от нее до тех пор, пока трос ДНК не будет захвачен. Переместите бусины в третий канал и сразу остановите поток во всех каналах.
Отрегулируйте мощность лазера 561 нм до четырех микроватт на панели возбуждающего лазера, а затем проведите тестовое сканирование ДНК в третьем канале. Если КМГ присутствует, она будет выглядеть как двумерные пятна, ограниченные дифракцией. В этом случае переместите трос ДНК на четвертый или пятый канал для визуализации.
В противном случае включите поток обратно, выбросьте бусины и повторите действия. В четвертый или пятый каналы введите два пиконьютона на панель силовой спектроскопии и нажмите на кнопку включения, чтобы запустить силовой зажим. Как только начальное напряжение достигнет двух пиконьютонов, отключите силовой зажим перед получением изображения, снова нажав кнопку включения на панели силовой спектроскопии.
Нажмите кнопку «Начать сканирование» на панели сканирования изображения. Визуализируйте CMG каждые пять секунд с помощью лазера с яркостью 561 нм и мощностью четыре микроватта, измеренной на объективе. В реакции, свободной от агрегации, CMG проявлялась в виде дискретных, симметричных дифракционно ограниченных пятен, редко скученных в ДНК.
Напротив, агрегаты представляют собой менее дискретные, иногда асимметричные капли, занимающие большую длину ДНК. Если анализ был успешно проведен и была достигнута высокая чистота очищенных белков, можно было наблюдать дальнее движение КМГ в присутствии АТФ.
