Общая цель этого исследования заключается в калибровке и испытании нового устройства, которое может быть использовано для измерения биомаркеров на месте в криосферных средах обитания. Устройство основано на лазерной индуцированной технологии выбросов флуоресценции, именуемой LIFE. Нынешние стандартные методы отбора проб приводят к физическому воздействию на образец в результате добычи, распада образцов путем сколов и распиливания, а также изменения температуры в результате таяния.
Эти методы часто приводят к фальсификации условий на месте. Поэтому решающее значение имеет новая методология обнаружения и характеристики микробной жизни на месте. Мы разработали новый неинвазивный, неразрушаемый метод с высоким пространственным и временным разрешением.
Применение лазерного метода излучения флуоресценции основано на том факте, что надледниковые среды населены, в частности, фототропными организмами. Эти организмы могут быть прослежены путем обнаружения флуоресцентных моделей порфиринов на основе аксессуаров пигментов хлорофилла И фикоэритрона, которые возбуждаются синим и зеленым лазером соответственно. Портативный двухволновой комплект весит 4,5 килограмма и используется на штативе в сочетании с внешним компьютером.
Трубка объектива направлена на образец. Затем зеленый пятимилваттный лазер попадает в образец после прохождения поляризационного сплиттера пучка, который перенаправляет поляризованный свет к оптической оси спектрометра. На экземпляре представлен флуоресцентный свет, иллюстрированный красным цветом.
Половина коллимированного света проходит поляризационный сплиттер пучка и фокусируется через фильтр длительного прохода, который удаляет лазерные сигналы. Далее сигнал попадает в щель диафрагмы, которая состоит из двух регулируемых лезвий бритвы. Спектрально призма отделяет тонкую линию света ортогональной к диафрагме щели, прежде чем сигнал захвачен на датчике.
Процедура повторяется с помощью синего лазера. Необработанные данные автоматически передаются на портативный компьютер, который также используется для работы программного обеспечения. Она разделена на три основных раздела.
Корректировка экспозиции делается вручную. Здесь коррекция между временем экспозиции и интенсивностью сигнала является линейной. Поле комментариев используется для описания образца.
В правом разделе необработанные изображения отображаются сразу же после завершения измерения. Эта функция имеет решающее значение для немедленной оценки данных на местах. Красные области указывают на переэкспонированные пиксели, которых можно избежать за счет сокращения времени экспозиции.
12-битные серые необработанные изображения показывают пространственный компонент из-за одномерной щели диафрагмы и спектрального компонента из-за призмы перед CCD. В ответ на оптические ограничения необработанные изображения искажаются. Таким образом, они должны быть обрезаны и dewarped путем применения кода, который признает степень искажения.
Далее калибровка длины волны делается с помощью 532 нанометрового лазера. Зеленый свет производится частотой удвоения 1064 нанометров инфракрасного лазера. Обе длины волн могут быть обнаружены CCD и, следовательно, спектральное положение каждого пикселя может быть рассчитано в dewarped изображений.
Затем изображение обрезается до данного диапазона длин волн. Серые значения с каждого пикселя в выбранной пиксельной строке подсчитываются и суммируются. Серое значение может варьироваться от нуля до 255.
После этого на каждую пиксельную линию приходится один номер. На этом графике серое значение, подсчитываемое из каждой пиксельной линии, построения по пространственным координатам. Это позволяет количественной пространственной дискриминации хлорофилла и фикоэритрона одновременно в образце.
Кроме того, спектральные свойства образца могут быть построены из выбранных линий пикселей. Настройка поля быстрая и легкая. Прикрепите инструмент на штатив.
Прикрепите трубку объектива к устройству. Прикрепите USB-кабель Arduino и кабель камеры. Подключите внешний компьютер с помощью USB-кабеля.
Отрегулируйте штатив ноги таким образом, чтобы трубка объектива покрывает образец. Запустите программное обеспечение, опишите образец и начните запуск измерения. Для калибровки пигмента подготовьтесь к серии разбавления из биржевого раствора.
Раствор хлорофилла А должен быть разбавлен ацетоном, а разбавление фикоэритрона осуществляется дистиллированной стерильной водой. Пятнадцать миллилитров каждого шага разбавления будут необходимы позже. Защитите пигменты от света, обернув их под алюминиевую фольгу.
Храните хлорофилл в морозильной камере и фикоэритрон в холодильнике до дальнейшего использования. Далее постройте стойку, как показано с разницей в высоту 1,5 сантиметра. Добавьте пять миллилитров самого высококонцентрированного разбавления в полицинтиляционный пластиковый флакон.
Этот объем приравнивается к 15-миллиметровой колонке воды во флаконе и измеряет интенсивность флуоресценции. Затем поместите флакон в среднее положение стойки и добавьте еще пять миллилитров того же раствора. Повторите процедуру с еще пятью миллилитров, который равен 45 миллиметров в высоту колонны.
Повторите процедуру со всеми шагами разбавления хлорофилла и фикоэритрона. Стойка и высота колонны играют важную роль для измерения, так как поверхность жидкостей находится в координационном центре прибора LIFE. Собирайте образцы снега и льда с ледника.
Кроме того, соберите образцы микробного коврика с ледникового поля. В этом исследовании, Midtre Lovenbreen, ледник рядом с научно-исследовательскими объектами Ню-Алесунн в высоком арктическом архипелаге Шпицберген был выбран. Растопить образцы снега и льда и вакуумный фильтр их под фильтрами GF/F.
Обратите внимание на отфильтрованный объем. Затем измерьте фильтры с помощью устройства LIFE на четырех случайных участках каждый в три раза с помощью зеленого и синего лазера. Рассчитайте общую концентрацию пигмента путем умножения плотности площади с фильтрованной областью и отфильтрованным объемом.
Нормализация концентрации пигмента до объема одного литра. Положите фильтры во флакон с 30 миллилитров ацетона и хранить их в темноте при четырех градусах по Цельсию на ночь. Затем возьмите флакон и поместите его на лед до sonication в течение двух минут на 50% мощности в непрерывном режиме.
Сожмите и удалите фильтр из флакона. Фильтр больше не нужен. Прикрепите трубку Tygon к шприцу и удалите смесь ацетона извлечения хлорофилла из флакона.
Замените трубку Tygon на держатель фильтра GF5. Перенесите раствор в кварцевый кювет. После калибровки спектрометра абсорбции для ацетона поместите образец, содержащий куветт, в спектрометр и измерьте особенности поглощения между 400 и 750 нанометров.
Затем снимите куветт со спектрометра и добавьте в образец 200 микролитров двух молярной соляной кислоты. Затем повторите измерение абсорбционности, чтобы измерить содержание феофитина в образце. Влияние лазерного измерения на активность бактериальных сообществ пока подробно не описано.
Таким образом, эффект был исследован с помощью первичного и вторичного производства. Для бактериальной продукции возьмите пять алицитов нашего бактериального коврика. Три алицита используются для поглощения леуцина с маркировкой трития, а две алициты используются в качестве элементов управления.
Инактивировать элементы управления формальдегидом. Добавьте леуцин с этикеткой трития ко всем алицитам. Повторите эту процедуру со всеми образцами.
Здесь показана необходимая сумма образца для нашей экспериментальной конструкции. Далее, разоблачить бактериальный коврик с зеленым и синим лазером, как указано в экспериментальной установки. Затем инактивировать все образцы, которые еще не были обработаны формальдегидом.
Перенесите образец в криовиальный и добавьте трихлороачетическую кислоту или TCA. Центрифуга флакона при 10 000 г в течение пяти минут. Добавьте жидкость для сцинтилляции и положите криовиал в полицинтиляционный флакон.
Проанализируйте образцы с помощью жидкого счетчика сцинтилляции и рассчитайте скорость поглощения. Для фотосинтеза подготовьтесь к пяти алицитам, две из которых затемнены. Добавьте радиоактивный трассировщик NaH14 CO3 и инкубировать в течение четырех часов.
После инкубации остановите реакцию, завернув образцы в алюминиевую фольгу. Измерьте распад в минуту жидким сцинтилляцией, как описано ранее. После нормализации данных для времени экспозиции в одну секунду и высоты выборочного столба в 15 миллиметров, окончательная линия калибровки была рассчитана с помощью регрессии Пуассона.
Корреляция между плотностью области и количеством фотона имеет линейный характер. Наклон кривой составляет 81,04. Это означает, что скорость подсчета фотонов 8, 104 в образце, выставленном в течение одной секунды, равна плотности области 100 нанограмм на сантиметр в квадрате фикоэритрона.
Стандартное отклонение в более концентрированных образцах может быть объяснено процессом самопоглощения в выборке. Кривая калибровки хлорофилла А показывает схожие характеристики и имеет линейный характер со наклоном 8,94. Шесть отфильтрованных образцов льда и снега были измерены с помощью прибора LIFE до извлечения хлорофилла и последующих измерений спектра абсорбции для анализа содержания хлорофилла.
Образцы заказываются по содержанию хлорофилла, приобретенного спектрометрией абсорбторанса. Данные LIFE показывают небольшие стандартные отклонения, которые свидетельствуют о том, что материал на фильтре был распределен относительно поровну. Инструмент LIFE недооценивает содержание хлорофилла в первых трех фильтрах.
Последние три фильтра, которые показывают более низкое содержание хлорофилла, переоцениваются инструментом LIFE. Причину несоответствия данных можно объяснить толщиной фильтра торта. В тонких фильтровах тортов, иллюстрированных оранжевым цветом, низкие сигналы флуоресценции похваскются из-за низкой плотности пигментов.
Сигналы хлорофилла А иллюстрируются красным цветом на этом сыром изображении. Все серые области на этом сыром изображении указывают на то, что фильтр сам проявляет лазерные сигналы после прохождения 450 нанометрового фильтра с длинным проходом. Программное обеспечение ошибочно засчитал этот сигнал как хлорофилл флуоресценции.
Высокое содержание пигмента было недооценено, потому что лазер не мог вызвать реакцию флуоресценции в молекулах хлорофилла А в более глубоких слоях фильтрова торта. Эксперимент с лазерным облучением не показывает существенного влияния на первичную и вторичную продуктивность бактериальных ковриков. Ни время экспозиции от 5 до 60 секунд, ни интенсивность лазера в диапазоне от пяти до 50 милливатт не показали никакого влияния на результаты производительности.
Это означает, что более высокая интенсивность и время экспозиции, необходимые для получения лучших сигналов, не навредят клеткам. Четыре криоконита были измерены на месте, и они сравниваются со стандартным раствором хлорофилла, который был измерен в лабораторных условиях, показанных красным цветом. Спектральные пики флуоресценции в синем цвете совпадают со стандартным спектром хлорофилла, обеспечивая тем самым концепцию измерений на месте.
Измерения LIFE проводились на почвах, бактериальных ковриках, биопленке и криоконитах. Измерения LIFE криоконитов с толстым осадочным слоем возможны, если площадь поверхности, покрытой криоконитом, превышает 12,5 сантиметра в квадрате. Этот тип криоконит блокирует рассеянный свет из-под льда.
В тонких слоях криокона сигналы флуоресценции окутаны окружающим светом. Соответственно, измерения LIFE голых поверхностей льда невозможны, в то время как все другие типы образцов могут быть проанализированы прибором LIFE. Изменения температуры приводят к повышению доступности жидкой воды, что приводит к повышению биологической активности на поверхности ледников.
Как следствие, концентрация пигмента может увеличиться. Крайне важно отслеживать эти изменения и прогнозировать возможные и вероятные будущие сценарии.
