Этот новый протокол описывает хирургическую анестезию у мышей с использованием пропофольной анестезии. Метод позволяет исследовать анестезию пропофолом на мышиных моделях заболевания. Протокол позволяет оценить общую внутривенную анестезию и позволяет избежать использования летучей анестезии.
Протокол может быть использован для изучения того, как анестезия пропофолом влияет на результаты, связанные с заболеванием. Например, здесь мы оцениваем краткосрочные и долгосрочные исходы рака после операции по удалению опухоли. Для начала культивируем 66 клеток рака молочной железы CL4 Mirai, которые стабильно трансдуцируются для экспрессии люциферазы светлячка в альфа-MEM-среде, содержащей 10% FBS и 200 миллимолярного глутамина.
Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия, но 5% углекислого газа. Субкультура клеток, когда клетки достигают примерно 80% конфлюентности. Когда клетки находятся в логарифмической фазе роста с двумя миллилитрами капель в растворе ЭДТА, поднимите адгезивные клетки и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
Затем разбавьте клетки в PBS и держите разбавленную клеточную суспензию на льду, пока мышь не будет готова к инъекции. После того, как мышь будет полностью обезболена, протрите четвертую левую область жировой прокладки молочной железы одноразовым спиртовым тампоном, чтобы подготовить место инъекции. Заполните 25-микролитровый шприц Гамильтона, прикрепленный к стерильной подкожной игле 27 калибра, суспензией раковых клеток.
Используйте щипцы для подтяжки и закрепления кожи. Введите один раз от 10 до пятой клетки и 20 микролитров PBS в четвертую левую жировую прокладку молочной железы примерно в одном миллиметре от соска. Если клетки помечены люциферазой, введите 100 микролитров D-люциферина в боковую хвостовую вену анестезированной мыши, используя 0,5-миллилитровый инсулиновый шприц с подкожной иглой 30 калибра.
Через две минуты после инъекции поместите мышь в систему визуализации биолюминесценции с прокладкой для молочного жира вверх и захватите изображение в течение 10 секунд. После визуализации поместите мышь в чистую клетку и дайте ей восстановиться после анестезии. Следите за ростом первичной опухоли с помощью суппорта.
Рассчитайте объем опухоли и резецируйте опухоль, когда первичная опухоль достигнет объема от 80 до 90 кубических миллиметров. Настройте автоматизированный шприцевой насос с инсулиновым шприцем 30 калибра в один миллилитр, содержащим двухпроцентный пропофол. Индуцировать анестезию в индукционной камере с трехпроцентным севофлураном или изофлураном.
Затем переведите обезболенную мышь на грелку при температуре 37 градусов Цельсия и поддерживайте анестезию двух-трехпроцентным севофлураном или изофлураном с помощью носового конуса. Отрегулируйте доставку севофлурана по мере необходимости во время внутривенной канюляции для поддержания стабильной глубины анестезии, демонстрируемой потерей педального рефлекса и частоты дыхания менее 100 вдохов в минуту. Нанесите водную смазку на глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы, а затем вводят 0,05 миллиграмма на килограмм бупренорфина подкожно.
Чтобы доставить полную внутривенную анестезию на основе пропофола, каннулируйте боковую хвостовую вену с помощью стерильной подкожной иглы 30 калибра, прикрепленной к стерильному полиуретановому катетеру. Подтвердите правильное размещение путем вспышек крови в катетер. Вводите двухпроцентный пропофол в качестве начального болюса 27 миллиграммов на килограмм в течение одной минуты, чтобы начать полную внутривенную анестезию.
Прекратить прием севофлурана. Поддерживайте инфузию пропофола со скоростью от 2,2 до 4,0 миллиграмм на килограмм в минуту для сохранения стабильной глубины анестезии во время операции. Сбрить область живота и продезинфицировать хирургическую область раствором повидона-йода.
Сделайте на один сантиметр разрез ниже опухоли в левой четвертой жировой подушке молочной железы. Используйте щипцы и ножницы для рассечения опухоли и левого пахового лимфатического узла. Если используются опухолевые клетки, помеченные люциферазой, вводят d-люциферин в боковую хвостовую вену, как показано на рисунке, и захватывают изображения в течение 60 секунд для получения четких полей.
При выявлении остаточной опухоли ресектируют дополнительную ткань из жировой прокладки молочной железы. Как только гемостаз будет достигнут в месте операции, закройте кожу с помощью 5-0 нейлоновых швов. Протрите рану раствором повидона-йода.
По завершении операции прекратите анестезию и поместите мышь в чистую клетку на грелке, чтобы она могла восстановиться после анестезии. Следите за мышью каждые 15 минут, пока мышь не вернется к нормальной бдительности. Затем контролируют и проводят обезболивание каждые 12 часов в течение 48 часов после операции.
Для первичной оценки рецидива опухоли или отдаленного рецидива контролируйте мышей один раз в неделю, начиная с недели после операции с использованием системы визуализации биолюминесценции. Биолюминесцентная визуализация использовалась для выявления отдаленного рецидива опухоли в легких после резекции первичной опухоли. Эта модель может быть использована для оценки событий, произошедших в периоперационном периоде.
Через 24 часа после операции по удалению рака под действием пропофола оценивали циркулирующие цитокины плазмы. Методы, необходимые для быстрого канюляции боковой хвостовой вены и минимизации продолжительности воздействия севофлурана. Севофлуран следует постепенно снижать титровать по мере введения пропофола болюса для предотвращения чрезмерной седации.
Этот метод может быть использован для исследования влияния анестезии пропофолом на мышиные модели кардиохирургии или критических заболеваний, таких как сепсис.
