Questo nuovo protocollo descrive l'anestesia chirurgica nei topi usando l'anestesia propofol. Il metodo consente la ricerca sull'anestesia con propofol in modelli murini di malattia. Il protocollo consente la valutazione dell'anestesia endovenosa totale ed evita l'uso dell'anestesia volatile.
Il protocollo può essere utilizzato per esplorare come l'anestesia con propofol influisce sugli esiti correlati alla malattia. Ad esempio, qui valutiamo gli esiti del cancro a breve e lungo termine dopo l'intervento chirurgico per rimuovere il tumore. Per iniziare, coltura 66 CL4 Mirai cellule tumorali mammarie che sono stabilmente trasdotte per esprimere lucciola luciferasi in mezzo alfa MEM contenente 10% FBS e 200 millimolari glutammina.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius ma 5% di anidride carbonica. Subcoltura le cellule quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza. Quando le cellule sono in una fase di crescita logaritmica con due millilitri di gocce in soluzione di EDTA, sollevare le cellule aderenti e contare le cellule usando un emocitometro.
Quindi diluire le cellule in PBS e mantenere la sospensione cellulare diluita sul ghiaccio fino a quando il topo è pronto per l'iniezione. Una volta che il topo è completamente anestetizzato, pulire la quarta area del cuscinetto di grasso mammario sinistro con un tampone imbevuto di alcool monouso per preparare il sito di iniezione. Riempire una siringa di Hamilton da 25 microlitri attaccata a un ago ipodermico sterile da 27 gauge con sospensione di cellule tumorali.
Utilizzare una pinza per sollevare e fissare la pelle. Iniettare una volta 10 alle quinte cellule e 20 microlitri di PBS nel quarto cuscinetto di grasso mammario sinistro a circa un millimetro dal capezzolo. Se le cellule sono contrassegnate con luciferasi, iniettare 100 microlitri di D-luciferina nella vena laterale della coda del topo anestetizzato utilizzando una siringa da insulina da 0,5 millilitri con un ago ipodermico da 30 gauge.
Due minuti dopo l'iniezione, posizionare il topo in un sistema di imaging a bioluminescenza con il cuscinetto di grasso mammario rivolto verso l'alto e catturare l'immagine per 10 secondi. Dopo l'imaging, posizionare il mouse nella gabbia pulita e consentirgli di riprendersi dall'anestesia. Monitorare la crescita della crescita del tumore primario utilizzando un calibro.
Calcolare il volume del tumore e resecare il tumore quando il tumore primario raggiunge 80-90 millimetri cubi di volume. Impostare la pompa a siringa automatizzata con una siringa da insulina da 30 millilitri contenente una formulazione di propofol al due percento. Indurre l'anestesia in una camera di induzione con sevoflurano o isoflurano al tre percento.
Quindi trasferire il topo anestetizzato su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius e mantenere l'anestesia con sevoflurano o isoflurano da due a tre percento utilizzando un cono nasale. Regolare l'erogazione di sevoflurano come richiesto durante l'incannulamento endovenoso per mantenere una profondità stabile dell'anestesia dimostrata dalla perdita del riflesso del pedale e dalla frequenza respiratoria inferiore a 100 respiri al minuto. Applicare lubrificante acquoso sugli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea, quindi iniettare 0,05 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina per via sottocutanea.
Per somministrare l'anestesia endovenosa totale a base di propofol, cannulare la vena laterale della coda utilizzando un ago ipodermico sterile calibro 30 attaccato a un catetere in poliuretano sterile. Confermare il corretto posizionamento mediante flashback di sangue nel catetere. Somministrare propofol al due percento come bolo iniziale di 27 milligrammi per chilogrammo in un minuto per iniziare l'anestesia endovenosa totale.
Cessare la somministrazione di sevoflurano. Mantenere l'infusione di propofol ad una velocità da 2,2 a 4,0 milligrammi per chilogrammo al minuto per mantenere stabile la profondità dell'anestesia durante l'intervento chirurgico. Rasare la regione addominale e disinfettare l'area chirurgica con una soluzione di iodio povidone.
Fai un'incisione di un centimetro inferiore al tumore nel quarto cuscinetto di grasso mammario sinistro. Utilizzare pinze e forbici per sezionare il tumore e il linfonodo inguinale sinistro. Se vengono utilizzate cellule tumorali marcate con luciferasi, iniettare d-luciferina nella vena laterale della coda come dimostrato e catturare le immagini per 60 secondi per ottenere margini chiari.
Se viene identificato un tumore residuo, resecare il tessuto aggiuntivo dal cuscinetto di grasso mammario. Una volta raggiunta l'emostasi nel sito chirurgico, chiudere la pelle utilizzando punti di sutura in nylon 5-0. Pulire la ferita con una soluzione di povidone-iodio.
Al termine dell'intervento chirurgico, interrompere l'anestesia e posizionare il topo in una gabbia pulita su una piastra elettrica per consentirgli di riprendersi dall'anestesia. Monitorare il mouse ogni 15 minuti fino a quando il mouse non ritorna alla normale vigilanza. Quindi monitorare e fornire analgesia ogni 12 ore per 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
Per la recidiva del tumore primario o la valutazione della recidiva a distanza, monitorare i topi una volta alla settimana, iniziando la settimana successiva all'intervento chirurgico utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza. L'imaging a bioluminescenza è stato utilizzato per identificare la recidiva del tumore a distanza nei polmoni dopo la resezione del tumore primario. Questo modello può essere utilizzato per valutare gli eventi che si sono verificati durante il periodo perioperatorio.
24 ore dopo l'intervento chirurgico del cancro sotto propofol, sono state valutate le citochine plasmatiche circolanti. Pratiche necessarie per incannulare rapidamente la vena laterale della coda e ridurre al minimo la durata dell'esposizione al sevoflurano. Il sevoflurano deve essere gradualmente sottotitolato man mano che il bolo di propofol viene somministrato per prevenire l'eccessiva sedazione.
Questo metodo può essere utilizzato per studiare l'impatto dell'anestesia con propofol in modelli murini di cardiochirurgia o malattie critiche, come la sepsi.
