Este novo protocolo descreve a anestesia cirúrgica em camundongos usando anestesia com propofol. O método permite a pesquisa sobre anestesia com propofol em modelos de doença em camundongos. O protocolo permite a avaliação da anestesia venosa total e evita o uso de anestesia volátil.
O protocolo pode ser usado para explorar como a anestesia com propofol afeta os resultados relacionados à doença. Por exemplo, aqui avaliamos os resultados do câncer a curto e longo prazo após a cirurgia para remover o tumor. Para começar, cultive 66 células cancerígenas mamárias CL4 Mirai que são transduzidas de forma estável para expressar luciferase de vagalume em meio alfa MEM contendo 10% de FBS e 200 milimolares de glutamina.
Incubar as células a 37 graus Celsius, mas 5% de dióxido de carbono. Subcultura das células quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência. Quando as células estão em uma fase de crescimento logarítmico com dois mililitros de gotejamentos em solução de EDTA, levante as células aderentes e conte as células usando um hemocitômetro.
Em seguida, dilua as células em PBS e mantenha a suspensão de células diluídas no gelo até que o rato esteja pronto para a injeção. Uma vez que o rato esteja completamente anestesiado, limpe a quarta área da almofada de gordura mamária esquerda com um cotonete com álcool de uso único para preparar o local da injeção. Encha uma seringa Hamilton de 25 microlitros presa a uma agulha hipodérmica estéril de calibre 27 com suspensão de células cancerígenas.
Use fórceps para levantar e prender a pele. Injete uma vez 10 para a quinta célula e 20 microlitros de PBS na quarta almofada de gordura mamária esquerda a aproximadamente um milímetro do mamilo. Se as células forem marcadas com luciferase, injete 100 microlitros de D-luciferina na veia lateral da cauda do rato anestesiado usando uma seringa de insulina de 0,5 mililitros com uma agulha hipodérmica de calibre 30.
Dois minutos após a injeção, coloque o rato num sistema de imagem de bioluminescência com a almofada de gordura mamária virada para cima e capture a imagem durante 10 segundos. Após a imagem, coloque o rato na gaiola limpa e deixe-o recuperar da anestesia. Monitore o crescimento do crescimento do tumor primário usando um paquímetro.
Calcule o volume do tumor e ressite o tumor quando o tumor primário atingir 80 a 90 milímetros cúbicos de volume. Configure a bomba de seringa automatizada com uma seringa de insulina de um mililitro de calibre 30 contendo dois por cento de formulação de propofol. Induza a anestesia em uma câmara de indução com três por cento de sevoflurano ou isoflurano.
Em seguida, transfira o rato anestesiado para uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius e mantenha a anestesia com dois a três por cento de sevoflurano ou isoflurano usando um cone nasal. Ajustar a administração de sevoflurano conforme necessário durante a canulação intravenosa para manter uma profundidade estável de anestesia demonstrada pela perda do reflexo do pedal e da frequência respiratória inferior a 100 respirações por minuto. Aplique lubrificante aquoso nos olhos para evitar o ressecamento da córnea e, em seguida, injete 0,05 miligrama por quilograma de buprenorfina por via subcutânea.
Para administrar a anestesia intravenosa total baseada em propofol, cular a veia lateral da cauda usando uma agulha hipodérmica estéril de calibre 30 presa a um cateter de poliuretano estéril. Confirme a colocação correta por flashback de sangue no cateter. Administrar dois por cento de propofol como um bolus inicial de 27 miligramas por quilograma durante um minuto para iniciar a anestesia intravenosa total.
Cessar a administração de sevoflurano. Manter a infusão de propofol a uma taxa de 2,2 a 4,0 miligramas por quilograma por minuto para manter a profundidade estável da anestesia durante a cirurgia. Raspe a região do abdômen e desinfete a área cirúrgica com solução de iodopovidona.
Faça uma incisão de um centímetro inferior ao tumor na almofada de gordura mamária da quarta esquerda. Use fórceps e tesouras para dissecar o tumor e o linfonodo inguinal esquerdo. Se forem utilizadas células tumorais marcadas com luciferase, injete d-luciferina na veia lateral da cauda, conforme demonstrado, e capture as imagens por 60 segundos para obter margens claras.
Se um tumor residual for identificado, resssecte o tecido adicional da almofada de gordura mamária. Uma vez que a hemostasia é alcançada no local da cirurgia, feche a pele usando suturas de nylon 5-0. Limpe a ferida com solução de iodopovidona.
Após a conclusão da cirurgia, pare a anestesia e coloque o rato em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento para permitir que ele se recupere da anestesia. Monitore o mouse a cada 15 minutos até que o mouse retorne ao estado de alerta normal. Em seguida, monitore e forneça analgesia a cada 12 horas por 48 horas após a cirurgia.
Para avaliação de recorrência de tumor primário ou recorrência à distância, monitore os camundongos uma vez por semana, iniciando a semana seguinte à cirurgia usando um sistema de imagem de bioluminescência. A imagem de bioluminescência foi utilizada para identificar a recidiva tumoral à distância nos pulmões após a ressecção do tumor primário. Esse modelo pode ser utilizado para avaliar eventos ocorridos durante o período perioperatório.
24 horas após a cirurgia oncológica sob propofol, citocinas plasmáticas circulantes foram avaliadas. Práticas necessárias para canular rapidamente a veia lateral da cauda e minimizar a duração da exposição ao sevoflurano. O sevoflurano deve ser gradualmente titulado para baixo à medida que o bolo de propofol é administrado para evitar a sedação excessiva.
Este método pode ser usado para investigar o impacto da anestesia com propofol em modelos de camundongos de cirurgia cardíaca ou doença crítica, como sepse.
