Этот протокол согласовывает измерения скорости оседания эритроцитов с последней физической моделью и обеспечивает более надежный анализ теста. Этот протокол позволяет более точно и систематически использовать скорость оседания эритроцитов, но также обеспечивает общепринятые значения. Ранее мы продемонстрировали, что этот метод особенно актуален при нарушениях с низким значением скорости оседания эритроцитов.
Он может быть использован для диагностических скринингов синдромов нейроакантоцитоза. Для начала соберите кровь в стандартные 9-миллилитровые пробирки с ЭДТА, а сыворотку — в стандартные 9-миллилитровые пробирки. Для оптимального уплотнения упакованных эритроцитов центрифугируют образцы крови в дозе 3 000 г в течение не менее семи минут и аспирируют надосадочную жидкость.
Теперь приготовьте смеси аутологичной плазмы и сыворотки с определенными пропорциями. Например, при приготовлении 2,5 миллилитров смеси сыворотки плазмы от 25% до 75% добавьте 0,625 миллилитра плазмы к 1,875 миллилитрам сыворотки. Ресуспендируйте гранулы в PBS или желаемой суспендирующей жидкости и аккуратно перемешайте после включения надосадочной жидкости для промывки.
Повторите трижды и выполните последнюю стирку с желаемой суспензионной жидкостью. Извлеките необходимый объем упакованных ячеек. Обрабатывают упакованные клетки как высоковязкую жидкость для образца объемом 4 миллилитра при гематокрите 45% Суспендировать 1,8 миллилитра упакованных клеток в пределах 2,2 миллилитра смеси плазменной сыворотки или любой другой желаемой жидкости.
Чтобы извлечь необходимое количество образца для определения гематокрита, строят капилляры микрогематокрита, погружая его нижний кончик в жидкость. Когда необходимое количество образца поднимется в пробирку с капиллярным всасыванием, закройте отверстие, чтобы остановить поток. Затем запечатайте капилляры сургучом, поместите их в центрифугу микрогематокрита и запустите их при 15 000 г в течение пяти минут в соответствии с инструкциями производителя.
Прочтите уровень гематокрита на капилляре и запишите его для справки. Теперь, чтобы записать осаждение образца, установите устойчивую камеру перед держателем, где трубки ESR будут оставлены в покое, и используйте белый фон с подсветкой для лучшего контраста. Используя пустые трубки Вестергрена без маркировки, установите фокус и поле зрения камеры, чтобы получить максимальное разрешение, где будут размещены образцы.
Убедитесь, что границы рисунков выровнены по вертикали и горизонтали. Затем сфотографируйте масштабированную трубку, чтобы извлечь разрешение в пикселях. Установите свет и время экспозиции камеры так, чтобы фон был белым, но не насыщенным.
Наполните нижнюю емкость пробирки Вестергрена объемом образцов, соответствующим инструкции производителя, и вставьте их в нижний контейнер, как указано производителем. Как только первая трубка будет готова, поместите ее в держатель и начните запись с камеры. Запись одного снимка каждую минуту обычно дает хорошее разрешение кинетической кривой ESR.
Подготовьте и разместите следующие образцы. Убедитесь, что вы не стоите перед каким-либо образцом во время снимка. После записи, чтобы извлечь кривую СОЭ с помощью кода MATLAB, выберите интересующую область, где видна только одна пробирка, часть, расположенная под самым нижним положением границы раздела бесклеточной плазмы эритроцитов, но внутри образца.
Запишите значения X, Y, W и H и используйте эти значения в сценарии MATLAB. Преобразуйте интересующую область изображения RGB в изображение или матрицу в оттенках серого. Обычно сочетание трех цветовых каналов очень эффективно с четким фоном.
Затем бинаризируйте картинку. Для здорового образца использование порога ARC2 обычно дает стабильный результат. Для образцов с высоким гематокритом или с некоторым гемолизом может быть лучше отрегулировать его вручную или использовать другой автоматический метод, в зависимости от точного контраста, полученного между различными фазами внутри пробирки.
Получите среднее значение значений пикселей GR по горизонтальному направлению. Этот шаг минимизирует шум и эффективно усредняет возможные неровности интерфейса. Прежде чем вычислять вариации, сгладьте кривую скользящей средней, особенно если трубки содержат некоторую горизонтальную разметку.
Затем определите положение интерфейса как точку с наибольшим изменением интенсивности и повторите для каждого изображения и каждого образца. Для каждого образца используйте любое подходящее программное обеспечение, чтобы сохранить положения интерфейса с течением времени в соответствующем формате, соответствующем физической модели. Используя любое подходящее программное обеспечение, зная гематокрит и начальную высоту столба крови, найдите значения времени задержки, безразмерного времени и конечной объемной доли эритроцитов, которые минимизируют сумму квадратов остаточных отклонений для физической модели.
После того, как количественная кривая будет извлечена из изображения, сохраните физические параметры образца. Традиционные значения СОЭ через 30 минут, один час или два часа все еще могут быть извлечены из кривой для справки. Скорость седиментации уменьшается с увеличением гематокрита или начальных объемных фракций.
Оседание эритроцитов замедляется при снижении концентрации фибриногена. Показано изменение максимальной скорости осаждения экстрагированного образца в зависимости от гематокрита образца и значений, полученных для безразмерного времени, конечной объемной доли эритроцита и времени задержки. Видно, что коррекция устраняет общую зависимость от исходного гематокрита, а также большую часть дисперсии данных.
Приведены характерные значения выделенных параметров для различных концентраций фибриногена. Начальная скорость седиментации в начале процесса седиментации увеличивается с увеличением концентрации фибриногена. Безразмерное характерное время осаждения уменьшается с увеличением концентрации фибриногена.
Конечная объемная доля осевших эритроцитов практически не зависит от концентрации фибриногена. Время задержки уменьшается с увеличением концентрации фибриногена, что указывает на то, что более сильные притягивающие взаимодействия ускоряют перестройку исходных структур эритроцитов, что приводит к образованию жидкостных каналов. Одним из важнейших моментов, связанных с получением изображения, является наличие равномерного яркого фона, верно?
Избегайте ярко выраженных теней вокруг трубок. Этот метод может быть использован для характеристики других заболеваний, связанных с более низкой скоростью оседания эритроцитов, таких как серповидноклеточная анемия или хроническая горная болезнь.
