Dieses Protokoll gleicht die Messungen der Blutsenkungsgeschwindigkeit mit dem neuesten physikalischen Modell ab und bietet eine robustere Analyse des Tests. Dieses Protokoll ermöglicht eine genauere und systematischere Verwendung der Blutsenkungsgeschwindigkeit, liefert aber auch die konventionellen Werte. Wir haben bereits gezeigt, dass diese Technik besonders für Erkrankungen mit einem niedrigen Blutsenkungswert relevant ist.
Es kann für diagnostische Screenings auf Neuroakanthozytose-Syndrome verwendet werden. Sammeln Sie zunächst das Blut in Standard-9-Milliliter-EDTA-Röhrchen und das Serum in Standard-9-Milliliter-Serumröhrchen. Für eine optimale Verdichtung der gepackten Erythrozyten werden die Blutproben bei 3.000 g mindestens sieben Minuten lang zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.
Stellen Sie nun Mischungen aus Eigenplasma und Serum mit bestimmten Anteilen her. Wenn Sie beispielsweise 2,5 Milliliter der 25%- bis 75%-Plasmaserummischung zubereiten, fügen Sie 0,625 Milliliter Plasma zu 1,875 Millilitern Serum hinzu. Resuspendieren Sie das Pellet in PBS oder der gewünschten Suspensionsflüssigkeit und mischen Sie es vorsichtig, nachdem Sie den Überstand zum Waschen eingefüllt haben.
Wiederholen Sie dies dreimal und führen Sie die letzte Wäsche mit der gewünschten Suspensionsflüssigkeit durch. Extrahieren Sie das erforderliche Volumen der gepackten Zellen. Verarbeiten Sie die verpackten Zellen als hochviskose Flüssigkeit für eine 4-Milliliter-Probe bei einem Hämatokrit von 45 %Suspendieren Sie 1,8 Milliliter gepackte Zellen innerhalb von 2,2 Millilitern der Plasmaserummischung oder einer anderen gewünschten Flüssigkeit.
Um die für die Hämatokritbestimmung erforderliche Probenmenge zu entnehmen, bauen Sie die Mikrohämatokritkapillaren auf, indem Sie die untere Spitze in die Flüssigkeit tauchen. Wenn die erforderliche Probenmenge im Röhrchen mit Kapillarabsaugung ansteigt, decken Sie die Öffnung ab, um den Durchfluss zu stoppen. Als nächstes versiegeln Sie die Kapillaren mit Siegellack, legen Sie sie in die Mikrohämatokritzentrifuge und lassen Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers fünf Minuten lang bei 15.000 g laufen.
Lesen Sie den Hämatokritwert an der Kapillare ab und notieren Sie ihn als Referenz. Um nun die Sedimentation der Probe aufzuzeichnen, stellen Sie eine stabile Kamera vor dem Halter auf, wo die ESR-Röhrchen ruhen, und verwenden Sie einen weißen, beleuchteten Hintergrund für einen besseren Kontrast. Verwenden Sie leere Westergren-Röhrchen ohne Markierungen, um den Fokus und das Sichtfeld der Kamera so einzustellen, dass die höchste Auflösung an der Stelle erreicht wird, an der die Proben platziert werden.
Stellen Sie sicher, dass die Ränder der Bilder in vertikaler und horizontaler Richtung ausgerichtet sind. Machen Sie dann ein Foto von einer skalierten Röhre, um die Pixelauflösung zu extrahieren. Stellen Sie das Licht und die Belichtungszeit der Kamera so ein, dass sie einen weißen Hintergrund, aber keine Sättigung haben.
Füllen Sie den unteren Behälter des Westergren-Röhrchens mit dem Volumen der Proben, das den Anweisungen des Herstellers entspricht, und legen Sie sie wie vom Hersteller angegeben in den unteren Behälter ein. Sobald die erste Röhre fertig ist, legen Sie sie in die Halterung und starten Sie die Kameraaufnahme. Die Aufnahme eines Bildes pro Minute ergibt in der Regel eine gute Auflösung der kinetischen ESR-Kurve.
Bereiten Sie die nächsten Proben vor und platzieren Sie sie. Stellen Sie sicher, dass Sie nicht vor einer Probe stehen, wenn ein Bild aufgenommen wird. Um nach der Aufzeichnung die ESR-Kurve mit dem MATLAB-Code zu extrahieren, wählen Sie einen Bereich von Interesse aus, in dem nur ein Röhrchen sichtbar ist, d. h. den Teil, der sich unter der untersten Position der Grenzfläche des erythrozytzellfreien Plasmas, aber innerhalb der Probe befindet.
Notieren Sie sich die Werte von X, Y, W und H und verwenden Sie diese Werte im MATLAB-Skript. Konvertieren Sie den Interessenbereich des RGB-Bildes in ein Graustufenbild oder eine Matrix. In der Regel ist die Kombination der drei Farbkanäle mit einem klaren Hintergrund sehr effizient.
Binarisieren Sie dann das Bild. Bei einer fehlerfreien Probe führt die Verwendung des ARC2-Schwellenwerts in der Regel zu einem konsistenten Ergebnis. Bei Proben mit einem hohen Hämatokrit oder einer gewissen Hämolyse kann es besser sein, ihn manuell anzupassen oder eine andere automatische Methode zu verwenden, abhängig vom genauen Kontrast, der zwischen den verschiedenen Phasen im Röhrchen erzielt wird.
Ermitteln Sie den Durchschnitt der Pixelwerte von GR entlang der horizontalen Richtung. Dieser Schritt minimiert das Rauschen und mittelt effizient die möglichen Unregelmäßigkeiten der Schnittstelle. Bevor Sie die Variationen berechnen, glätten Sie die Kurve mit einem gleitenden Durchschnitt, insbesondere wenn die Röhren einige horizontale Markierungen enthalten.
Identifizieren Sie dann die Grenzflächenposition als den Punkt mit der höchsten Intensitätsvariation und wiederholen Sie den Vorgang für jedes Bild und jede Probe. Verwenden Sie für jede Probe eine geeignete Software, um die Positionen der Schnittstelle im Laufe der Zeit in einem geeigneten Format zu speichern, das dem physischen Modell entspricht. Finden Sie mit einer geeigneten Software, die den Hämatokrit und die Anfangshöhe der Blutsäule kennt, die Werte der Verzögerungszeit, der dimensionslosen Zeit und des endgültigen gepackten Volumenanteils der Erythrozyten, die die Summe der quadrierten Restabweichungen für das physikalische Modell minimieren.
Sobald die quantitative Kurve aus dem Bild extrahiert wurde, speichern Sie die physikalischen Parameter der Probe. Herkömmliche ESR-Werte nach 30 Minuten, einer Stunde oder zwei Stunden können weiterhin als Referenz aus der Kurve extrahiert werden. Die Sedimentationsgeschwindigkeit nimmt mit zunehmendem Hämatokrit bzw. anfänglichen Volumenanteilen ab.
Die Sedimentation der Erythrozyten wird langsamer, wenn die Fibrinogenkonzentration abnimmt. Die Variation der extrahierten maximalen Sedimentationsgeschwindigkeit in Abhängigkeit vom Hämatokrit der Probe und den erhaltenen Werten für die dimensionslose Zeit, den endgültigen Volumenanteil des Erythrozyten und die Verzögerungszeit wird dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Korrektur die Gesamtabhängigkeit vom initialen Hämatokrit sowie den größten Teil der Datenstreuung aufhebt.
Die Kennwerte der extrahierten Parameter für verschiedene Fibrinogenkonzentrationen werden dargestellt. Die anfängliche Sedimentationsgeschwindigkeit zu Beginn des Sedimentationsprozesses steigt mit zunehmender Fibrinogenkonzentration. Die dimensionslose charakteristische Sedimentationszeit nimmt mit steigender Fibrinogenkonzentration ab.
Der endgültige Volumenanteil der sedimentierten Erythrozyten ist nahezu unabhängig von der Fibrinogenkonzentration. Die Verzögerungszeit nimmt mit steigender Fibrinogenkonzentration ab, was darauf hindeutet, dass stärkere anziehende Wechselwirkungen die Umlagerung der anfänglichen Erythrozytenstrukturen beschleunigen, was zur Bildung von Flüssigkeitskanälen führt. Einer der kritischen Punkte bei der Bildaufnahme ist ein gleichmäßig heller Hintergrund, oder?
Vermeiden Sie ausgeprägte Schatten um die Röhren herum. Die Technik könnte für die Charakterisierung anderer Krankheiten verwendet werden, die mit einer niedrigeren Blutsenkungsgeschwindigkeit verbunden sind, wie z. B. Sichelzellenanämie oder chronische Bergkrankheit.
