Este protocolo alinha as medidas da velocidade de hemossedimentação com o modelo físico mais recente e fornece uma análise mais robusta do teste. Este protocolo permite uma utilização mais precisa e sistemática da velocidade de hemossedimentação, mas também fornece os valores convencionais. Demonstramos anteriormente que esta técnica é particularmente relevante para doenças que apresentam baixo valor de velocidade de hemossedimentação.
Ele pode ser usado para rastreios diagnósticos para síndromes de neuroacantocitose. Para começar, colete o sangue em tubos padrão de EDTA de 9 mililitros e o soro em tubos de soro padrão de 9 mililitros. Para uma compactação ideal dos eritrócitos concentrados, centrifugar as amostras de sangue a 3.000 g durante pelo menos sete minutos e aspirar o sobrenadante.
Agora preparar misturas de plasma autólogo e soro com proporções determinadas. Por exemplo, ao preparar 2,5 mililitros da mistura de soro plasmático de 25% a 75%, adicione 0,625 mililitros de plasma a 1,875 mililitros de soro. Ressuspenda o pellet em PBS ou o líquido de suspensão desejado e misture suavemente após incluir o sobrenadante para lavagem.
Repita três vezes e realize a última lavagem com o líquido de suspensão desejado. Extraia o volume necessário de células embaladas. Processar as células embaladas como um líquido altamente viscoso para uma amostra de 4 mililitros em um hematócrito de 45%Suspender 1,8 mililitros de células embaladas dentro de 2,2 mililitros da mistura de soro plasmático ou qualquer outro líquido desejado.
Para extrair a quantidade necessária de amostra para a determinação do hematócrito, construa os capilares do microhematócrito imergindo sua ponta inferior no líquido. Quando a quantidade necessária de amostra subir no tubo com sucção capilar, cubra a abertura para interromper o fluxo. Em seguida, sele os capilares com cera selante, coloque-os na centrífuga de microhematócrito e execute-os a 15.000 g por cinco minutos, conforme instruções do fabricante.
Leia o nível do hematócrito no capilar e anote-o para referência. Agora, para registrar a sedimentação da amostra, configure uma câmera estável na frente do suporte, onde os tubos ESR serão deixados em repouso, e use um fundo branco iluminado para melhor contraste. Usando tubos Westergren vazios sem marcações, defina o foco e o campo de visão da câmera para obter a mais alta resolução onde as amostras serão colocadas.
Certifique-se de que as bordas das imagens estejam alinhadas nas direções vertical e horizontal. Em seguida, tire uma foto de um tubo dimensionado para extrair a resolução de pixels. Defina a luz e o tempo de exposição da câmera para ter um fundo branco, mas sem saturação.
Encha o recipiente inferior do tubo Westergren com o volume das amostras correspondente às instruções do fabricante e insira-as no recipiente inferior, conforme indicado pelo fabricante. Quando o primeiro tubo estiver pronto, coloque-o no suporte e inicie a gravação da câmera. Gravar uma imagem a cada minuto geralmente dá uma boa resolução da curva cinética da VHS.
Prepare e coloque as próximas amostras. Certifique-se de não ficar diante de qualquer amostra quando uma foto for tirada. Após o registro, para extrair a curva de VHS usando o código MATLAB, selecione uma região de interesse onde apenas um tubo é visível, a parte localizada sob a posição mais baixa da interface plasma livre de células eritrocitárias, mas dentro da amostra.
Anote os valores de X, Y, W e H e use esses valores no script MATLAB. Converta a região de interesse da imagem RGB em uma imagem ou matriz em tons de cinza. Normalmente, combinar os três canais de cores é muito eficiente com um fundo claro.
Em seguida, binarize a imagem. Para uma amostra saudável, o uso do limiar ARC2 geralmente fornece um resultado consistente. Para amostras com hematócrito alto ou com alguma hemólise, talvez seja melhor ajustá-lo manualmente ou usar outro método automático, dependendo do contraste exato obtido entre as várias fases dentro do tubo.
Obtenha a média dos valores de pixel de GR ao longo da direção horizontal. Esta etapa minimiza o ruído e calcula eficientemente as possíveis irregularidades da interface. Antes de calcular as variações, suavize a curva com uma média móvel, especialmente se os tubos contiverem algumas marcações horizontais.
Em seguida, identifique a posição da interface como o ponto com maior variação de intensidade e repita para cada figura e cada amostra. Para cada amostra, use qualquer software adequado para salvar as posições da interface ao longo do tempo em um formato apropriado para se ajustar ao modelo físico. Usando qualquer software adequadamente ajustado, conhecendo o hematócrito e a altura inicial da coluna sanguínea, encontre os valores do tempo de atraso, do tempo adimensional e da fração de volume do empacotamento final dos eritrócitos, que minimizam a soma dos desvios residuais quadrados para o modelo físico.
Uma vez extraída a curva quantitativa da imagem, salve os parâmetros físicos da amostra. Os valores tradicionais de VHS em 30 minutos, uma hora ou duas horas ainda podem ser extraídos da curva para referência. A velocidade de sedimentação diminui com o aumento do hematócrito ou das frações de volume inicial.
A sedimentação dos eritrócitos torna-se mais lenta quando a concentração de fibrinogênio diminui. A variação da velocidade máxima de sedimentação extraída em função do hematócrito da amostra e dos valores obtidos para o tempo adimensional, a fração de volume empacotado final do eritrócito e o tempo de atraso é mostrada. Pôde-se observar que a correção elimina a dependência global do hematócrito inicial, bem como a maior parte da dispersão dos dados.
Valores característicos dos parâmetros extraídos para várias concentrações de fibrinogênio são mostrados. A velocidade de sedimentação inicial no início do processo de sedimentação aumenta com o aumento da concentração de fibrinogênio. O tempo característico adimensional de sedimentação diminui com o aumento da concentração de fibrinogênio.
A fração de volume final dos eritrócitos sedimentados é quase independente da concentração de fibrinogênio. O tempo de atraso diminui com o aumento da concentração de fibrinogênio, indicando que interações atrativas mais fortes aceleram o rearranjo das estruturas eritrocitárias iniciais que levam ao estabelecimento de canais fluidos. Um dos pontos críticos em relação à aquisição da imagem é ter um fundo brilhante uniforme, certo?
Evite sombras pronunciadas ao redor dos tubos. A técnica poderia ser utilizada para a caracterização de outras doenças associadas à menor velocidade de hemossedimentação, como a anemia falciforme ou a doença crônica da montanha.
