Questo protocollo allinea le misurazioni della velocità di eritrosedimentazione con l'ultimo modello fisico e fornisce un'analisi più robusta del test. Questo protocollo consente un uso più accurato e sistematico della velocità di eritrosedimentazione, ma fornisce anche i valori convenzionali. Abbiamo precedentemente dimostrato che questa tecnica è particolarmente rilevante per i disturbi che presentano un basso valore di velocità di eritrosedimentazione.
Può essere utilizzato per screening diagnostici per sindromi neuroacantocitosi. Per iniziare, raccogliere il sangue in provette EDTA standard da 9 millilitri e il siero in provette di siero standard da 9 millilitri. Per una compattazione ottimale degli eritrociti imballati, centrifugare i campioni di sangue a 3.000 g per almeno sette minuti e aspirare il surnatante.
Ora prepara miscele di plasma autologo e siero con proporzioni determinate. Ad esempio, quando si preparano 2,5 millilitri della miscela di siero al plasma dal 25% al 75%, aggiungere 0,625 millilitri di plasma a 1,875 millilitri di siero. Risospendere il pellet in PBS o nel liquido di sospensione desiderato e mescolare delicatamente dopo aver incluso il surnatante per il lavaggio.
Ripetere tre volte ed eseguire l'ultimo lavaggio con il liquido di sospensione desiderato. Estrarre il volume richiesto di celle compresse. Elaborare le cellule imballate come un liquido altamente viscoso per un campione di 4 millilitri a un ematocrito del 45% Sospendere 1,8 millilitri di cellule imballate entro 2,2 millilitri dalla miscela di siero al plasma o da qualsiasi altro liquido desiderato.
Per estrarre la quantità necessaria di campione per la determinazione dell'ematocrito, costruire i capillari del microematocrito immergendo la sua punta inferiore nel liquido. Quando la quantità richiesta di campione sale nel tubo con aspirazione capillare, coprire l'apertura per interrompere il flusso. Quindi, sigillare i capillari con ceralacca, metterli nella centrifuga microematocrito e farli funzionare a 15.000 g per cinque minuti, secondo le istruzioni del produttore.
Leggere il livello di ematocrito sul capillare e scriverlo per riferimento. Ora, per registrare la sedimentazione del campione, impostare una telecamera fissa davanti al supporto in cui i tubi ESR verranno lasciati a riposo e utilizzare uno sfondo bianco illuminato per un migliore contrasto. Utilizzando tubi Westergren vuoti senza segni, impostare la messa a fuoco e il campo visivo della telecamera per ottenere la massima risoluzione in cui verranno posizionati i campioni.
Assicurarsi che i bordi delle immagini siano allineati in direzione verticale e orizzontale. Quindi scatta una foto di un tubo in scala per estrarre la risoluzione dei pixel. Imposta la luce e il tempo di esposizione della fotocamera in modo che abbiano uno sfondo bianco ma senza saturazione.
Riempire il contenitore inferiore del tubo Westergren con il volume dei campioni corrispondente alle istruzioni del produttore e inserirli nel contenitore inferiore, come indicato dal produttore. Una volta che il primo tubo è pronto, posizionarlo nel supporto e avviare la registrazione della fotocamera. La registrazione di un'immagine ogni minuto di solito fornisce una buona risoluzione della curva cinetica ESR.
Preparare e posizionare i campioni successivi. Assicurarsi di non stare davanti a nessun campione quando viene scattata una foto. Dopo la registrazione, per estrarre la curva ESR utilizzando il codice MATLAB, selezionare una regione di interesse in cui è visibile solo un tubo, la parte situata nella posizione più bassa dell'interfaccia del plasma privo di cellule eritrocitarie ma all'interno del campione.
Annotare i valori di X, Y, W e H e utilizzare questi valori nello script MATLAB. Convertite l'area di interesse dell'immagine RGB in un'immagine o matrice in scala di grigi. Di solito, la combinazione dei tre canali di colore è molto efficiente con uno sfondo chiaro.
Quindi binarizzare l'immagine. Per un campione sano, l'utilizzo della soglia ARC2 di solito dà un risultato coerente. Per i campioni con un ematocrito alto o con qualche emolisi, potrebbe essere meglio regolarlo manualmente o utilizzare un altro metodo automatico, a seconda dell'esatto contrasto ottenuto tra le varie fasi all'interno del tubo.
Ottenere la media dei valori dei pixel di GR lungo la direzione orizzontale. Questo passaggio riduce al minimo il rumore e calcola in modo efficiente la media delle possibili irregolarità dell'interfaccia. Prima di calcolare le variazioni, smussare la curva con una media mobile, soprattutto se i tubi contengono alcuni segni orizzontali.
Quindi identifica la posizione dell'interfaccia come il punto con la variazione di intensità più alta e ripeti per ogni immagine e ogni campione. Per ogni campione, utilizzare qualsiasi software adatto per salvare le posizioni dell'interfaccia nel tempo in un formato appropriato per adattarsi al modello fisico. Utilizzando qualsiasi software opportunamente adatto, conoscendo l'ematocrito e l'altezza iniziale della colonna sanguigna, trovare i valori del tempo di ritardo, del tempo adimensionale e della frazione di volume finale degli eritrociti, che minimizzano la somma delle deviazioni residue al quadrato per il modello fisico.
Una volta estratta la curva quantitativa dall'immagine, salvare i parametri fisici del campione. I valori ESR tradizionali a 30 minuti, un'ora o due ore possono ancora essere estratti dalla curva per riferimento. La velocità di sedimentazione diminuisce con l'aumentare dell'ematocrito o delle frazioni di volume iniziali.
La sedimentazione degli eritrociti diventa più lenta quando la concentrazione di fibrinogeno diminuisce. Viene mostrata la variazione della velocità massima di sedimentazione estratta in funzione dell'ematocrito del campione e i valori ottenuti per il tempo adimensionale, la frazione finale di volume impacchettata dell'eritrocita e il tempo di ritardo. Si è potuto vedere che la correzione rimuove la dipendenza complessiva dall'ematocrito iniziale e la maggior parte della dispersione dei dati.
Vengono mostrati i valori caratteristici dei parametri estratti per varie concentrazioni di fibrinogeno. La velocità di sedimentazione iniziale all'inizio del processo di sedimentazione aumenta con un aumento della concentrazione di fibrinogeno. Il tempo caratteristico adimensionale di sedimentazione diminuisce con l'aumentare della concentrazione di fibrinogeno.
La frazione volumetrica finale degli eritrociti sedimentati è quasi indipendente dalla concentrazione di fibrinogeno. Il tempo di ritardo diminuisce con l'aumentare della concentrazione di fibrinogeno, indicando che interazioni attrattive più forti accelerano il riarrangiamento delle strutture eritrocitarie iniziali che porta alla creazione di canali fluidi. Uno dei punti critici per quanto riguarda l'acquisizione delle immagini è avere uno sfondo luminoso uniforme, giusto?
Evitare ombre pronunciate intorno ai tubi. La tecnica potrebbe essere utilizzata per la caratterizzazione di altre malattie associate a una minore velocità di eritrosedimentazione, come l'anemia falciforme o il mal di montagna cronico.
