このプロトコルは、赤血球沈降速度の測定値を最新の物理モデルに合わせ、テストのより堅牢な分析を提供します。このプロトコルは、赤血球沈降速度のより正確かつ体系的な使用を可能にするが、従来の値も提供する。我々は以前、この技術が低い赤血球沈降速度値を示す障害に特に関連していることを実証した。
神経表皮球症症候群の診断スクリーニングに使用できます。まず、血液を標準の9ミリリットルEDTAチューブに、血清を標準の9ミリリットル血清チューブに集めます。充填された赤血球を最適に圧縮するには、血液サンプルを3, 000 gで少なくとも7分間遠心分離し、上清を吸引します。
次に、決定された比率で自己血漿と血清の混合物を調製します。例えば、2.5ミリリットルの25%〜75%血漿血清混合物を調製する場合、0.625ミリリットルの血漿を1.875ミリリットルの血清に加える。ペレットをPBSまたは所望の懸濁液に再懸濁し、洗浄用の上清を含めた後、穏やかに混合する。
3回繰り返し、希望の懸濁液で最後の洗浄を行います。必要な量のパックセルを抽出します。45%のヘマトクリット値で4ミリリットルのサンプル用の高粘度液体としてパックされた細胞を45%処理する血漿血清混合物またはその他の所望の液体から2.2ミリリットル以内に1.8ミリリットルのパックセルを懸濁します。
ヘマトクリット測定に必要な量のサンプルを抽出するには、マイクロヘマトクリットの毛細血管の下部先端を液体に浸して構築します。毛細管吸引でチューブ内で必要量のサンプルが上昇したら、開口部を覆って流れを停止します。次に、キャピラリーをシーリングワックスで密封し、マイクロヘマトクリット遠心分離機に入れ、製造元の指示に従って15, 000 gで5分間運転します。
毛細血管のヘマトクリットレベルを読み、参照用に書き留めます。次に、サンプルの沈降を記録するには、ESRチューブを静止させるホルダーの前に安定したカメラを設置し、コントラストを高めるために白い照らされた背景を使用します。マーキングのない空のウェスターグレンチューブを使用して、カメラの焦点と視野を設定し、サンプルが配置される最高の解像度を取得します。
画像の境界線が垂直方向と水平方向に揃えられていることを確認します。次に、スケーリングされたチューブの写真を撮り、ピクセル解像度を抽出します。カメラの光と露出時間を白い背景に設定しますが、彩度はありません。
ウェスターグレン管の底部容器に製造元の指示に対応するサンプルの量を満たし、製造元の指示に従って下部容器に挿入します。最初のチューブの準備ができたら、ホルダーに入れてカメラの録画を開始します。毎分1枚の画像を記録すると、通常、ESR運動曲線の良好な解像度が得られます。
次のサンプルを準備して配置します。写真を撮るときは、サンプルの前に立たないようにしてください。記録後、MATLABコードを使用してESR曲線を抽出するには、1本のチューブのみが見える関心領域、赤血球無細胞血漿インターフェースの最下に位置するがサンプル内にある部分を選択します。
X、Y、W、H の値をメモし、これらの値を MATLAB スクリプトで使用します。RGB画像の関心領域をグレースケール画像またはマトリックスに変換します。通常、3つのカラーチャンネルを組み合わせることは、背景が鮮明で非常に効率的です。
次に、画像を二値化します。正常なサンプルの場合、通常、ARC2閾値を使用すると一貫した結果が得られます。ヘマトクリット値が高いサンプルや溶血のあるサンプルの場合は、チューブ内のさまざまな相間で得られる正確なコントラストに応じて、手動で調整するか、別の自動方法を使用することをお勧めします。
水平方向に沿ったGRのピクセル値の平均値を取得します。このステップにより、ノイズが最小限に抑えられ、起こりうる界面の不規則性を効率的に平均化できます。変動を計算する前に、特にチューブに水平方向のマーキングが含まれている場合は、移動平均で曲線を滑らかにします。
次に、界面位置を強度変動が最も高い点として特定し、各画像と各サンプルに対して繰り返します。各サンプルについて、適切なソフトウェアを使用して、物理モデルに適合する適切な形式でインターフェイスの位置を経時的に保存します。適切なソフトウェアを使用して、ヘマトクリット値と血液柱の初期高さを知り、赤血球の遅延時間、無次元時間、および最終的な充填体積分率の値を見つけ、物理モデルの二乗残留偏差の合計を最小限に抑えます。
写真から定量曲線が抽出されたら、サンプルの物理的パラメータを保存します。30分、1時間、または2時間の従来のESR値は、参照用に曲線から抽出できます。沈降速度は、ヘマトクリット値または初期体積分率の増加とともに減少します。
フィブリノーゲンの濃度が低下すると赤血球の沈降が遅くなる。無次元時間について得られた値およびサンプルヘマトクリットの関数としての抽出最大沈降速度の変化、赤血球の最終充填体積分率、および遅延時間が示される。この補正により、最初のヘマトクリット値への全体的な依存性とほとんどのデータ分散が取り除かれることがわかります。
様々なフィブリノーゲン濃度について抽出されたパラメータの特性値が示されている。沈降プロセスの開始時の初期沈降速度は、フィブリノーゲン濃度の増加とともに増加する。沈降の無次元特性時間は、フィブリノーゲン濃度の増加とともに減少する。
沈降赤血球の最終的な体積分率は、フィブリノーゲン濃度とほぼ無関係です。遅延時間はフィブリノーゲン濃度の増加とともに減少し、より強い引力相互作用が初期赤血球構造の再配列を加速し、流体チャネルの確立につながることを示しています。画像取得に関する重要なポイントの1つは、均一な明るい背景を持つことですよね?
チューブの周りの顕著な影を避けてください。この技術は、鎌状赤血球貧血や慢性高山病など、赤血球沈降速度の低下に関連する他の疾患の特性評価に使用できます。
