Ce protocole aligne les mesures de la vitesse de sédimentation érythrocytaire avec le dernier modèle physique et fournit une analyse plus robuste du test. Ce protocole permet une utilisation plus précise et systématique de la vitesse de sédimentation érythrocytes, mais fournit également les valeurs conventionnelles. Nous avons précédemment démontré que cette technique est particulièrement pertinente pour les troubles présentant une faible valeur de vitesse de sédimentation érythrocytes.
Il peut être utilisé pour les dépistages diagnostiques des syndromes de neuroacanthocytose. Pour commencer, recueillez le sang dans des tubes EDTA standard de 9 millilitres et le sérum dans des tubes de sérum standard de 9 millilitres. Pour un compactage optimal des érythrocytes emballés, centrifuger les échantillons de sang à 3 000 g pendant au moins sept minutes et aspirer le surnageant.
Préparez maintenant des mélanges de plasma et de sérum autologues avec des proportions déterminées. Par exemple, lors de la préparation de 2,5 millilitres du mélange de sérum plasmatique à 25% à 75%, ajoutez 0,625 millilitre de plasma à 1,875 millilitre de sérum. Remettez en suspension la pastille dans du PBS ou du liquide en suspension désiré et mélangez délicatement après avoir inclus le surnageant pour le lavage.
Répétez trois fois et effectuez le dernier lavage avec le liquide en suspension souhaité. Extraire le volume requis de cellules emballées. Traiter les cellules emballées comme un liquide hautement visqueux pour un échantillon de 4 millilitres à un hématocrite de 45%Suspendre 1,8 millilitre de cellules emballées à moins de 2,2 millilitres du mélange de sérum plasmatique ou de tout autre liquide désiré.
Pour extraire la quantité requise d’échantillon pour la détermination de l’hématocrite, construisez les capillaires du microhématocrite en immergeant son extrémité inférieure dans le liquide. Lorsque la quantité requise d’échantillon augmente dans le tube avec aspiration capillaire, couvrir l’ouverture pour arrêter l’écoulement. Ensuite, scellez les capillaires avec de la cire à cacheter, placez-les dans la centrifugeuse à microhématocrite et faites-les fonctionner à 15 000 g pendant cinq minutes, conformément aux instructions du fabricant.
Lisez le niveau d’hématocrite sur le capillaire et écrivez-le pour référence. Maintenant, pour enregistrer la sédimentation de l’échantillon, installez une caméra stable devant le support où les tubes ESR seront laissés au repos, et utilisez un fond blanc éclairé pour un meilleur contraste. En utilisant des tubes Westergren vides sans marquages, réglez la mise au point et le champ de vision de la caméra pour obtenir la résolution la plus élevée où les échantillons seront placés.
Assurez-vous que les bordures des images sont alignées dans les directions verticale et horizontale. Prenez ensuite une photo d’un tube à l’échelle pour extraire la résolution en pixels. Réglez la lumière et le temps d’exposition de l’appareil photo pour qu’ils aient un arrière-plan blanc mais pas de saturation.
Remplissez le récipient inférieur du tube Westergren avec le volume des échantillons correspondant aux instructions du fabricant et insérez-les dans le récipient inférieur, comme indiqué par le fabricant. Une fois que le premier tube est prêt, placez-le dans le support et démarrez l’enregistrement de la caméra. L’enregistrement d’une image toutes les minutes donne généralement une bonne résolution de la courbe cinétique ESR.
Préparez et placez les échantillons suivants. Assurez-vous de ne pas vous tenir devant un échantillon lorsqu’une photo est prise. Après l’enregistrement, pour extraire la courbe ESR à l’aide du code MATLAB, sélectionnez une région d’intérêt où un seul tube est visible, la partie située sous la position la plus basse de l’interface plasma acellulaire érythrocytaire mais à l’intérieur de l’échantillon.
Notez les valeurs de X, Y, W et H et utilisez ces valeurs dans le script MATLAB. Convertissez la région d’intérêt de l’image RVB en une image ou une matrice en niveaux de gris. Habituellement, la combinaison des trois canaux de couleur est très efficace avec un arrière-plan clair.
Ensuite, binarisez l’image. Pour un échantillon sain, l’utilisation du seuil ARC2 donne généralement un résultat cohérent. Pour les échantillons présentant un hématocrite élevé ou une certaine hémolyse, il peut être préférable de l’ajuster manuellement ou d’utiliser une autre méthode automatique, en fonction du contraste exact obtenu entre les différentes phases à l’intérieur du tube.
Obtenir la moyenne des valeurs de pixels de GR le long de la direction horizontale. Cette étape minimise le bruit et calcule efficacement la moyenne des irrégularités possibles de l’interface. Avant de calculer les variations, lissez la courbe avec une moyenne mobile, surtout si les tubes contiennent des marques horizontales.
Ensuite, identifiez la position de l’interface comme le point avec la variation d’intensité la plus élevée, et répétez pour chaque image et chaque échantillon. Pour chaque exemple, utilisez n’importe quel logiciel approprié pour enregistrer les positions de l’interface au fil du temps dans un format approprié pour s’adapter au modèle physique. À l’aide de n’importe quel logiciel adapté, connaissant l’hématocrite et la hauteur initiale de la colonne sanguine, trouvez les valeurs du temps de retard, du temps sans dimension et de la fraction volumique finale des érythrocytes, qui minimisent la somme des écarts résiduels au carré pour le modèle physique.
Une fois la courbe quantitative extraite de l’image, enregistrez les paramètres physiques de l’échantillon. Les valeurs ESR traditionnelles à 30 minutes, une heure ou deux heures peuvent encore être extraites de la courbe pour référence. La vitesse de sédimentation diminue avec l’augmentation de l’hématocrite ou des fractions volumiques initiales.
La sédimentation des érythrocytes devient plus lente lorsque la concentration de fibrinogène diminue. La variation de la vitesse maximale de sédimentation extraite en fonction de l’hématocrite de l’échantillon et des valeurs obtenues pour le temps sans dimension, la fraction volumique compacte finale de l’érythrocyte et le temps de retard, est montrée. On a pu voir que la correction supprime la dépendance globale à l’hématocrite initial ainsi que la plupart de la dispersion des données.
Les valeurs caractéristiques des paramètres extraits pour diverses concentrations de fibrinogène sont indiquées. La vitesse de sédimentation initiale au début du processus de sédimentation augmente avec l’augmentation de la concentration en fibrinogène. Le temps caractéristique de sédimentation sans dimension diminue avec l’augmentation de la concentration de fibrinogène.
La fraction volumique finale des érythrocytes sédimentés est presque indépendante de la concentration en fibrinogène. Le temps de retard diminue avec l’augmentation de la concentration de fibrinogène, ce qui indique que des interactions attractives plus fortes accélèrent le réarrangement des structures érythrocytaires initiales qui conduit à l’établissement de canaux fluides. L’un des points critiques concernant l’acquisition d’image est d’avoir un fond lumineux uniforme, non?
Évitez les ombres prononcées autour des tubes. La technique pourrait être utilisée pour la caractérisation d’autres maladies associées à une vitesse de sédimentation érythrocytaire inférieure, telles que la drépanocytose ou le mal chronique des montagnes.
