Этот метод демонстрирует воспроизводимый метод выделения эпителиальных клеток, обнаруженных в крови и костном мозге здоровых людей, для дальнейшего анализа. Этот метод позволяет изолировать эпителиальные клетки за небольшую часть стоимости автоматического выделения циркулирующих опухолевых клеток из-за доступности проточной цитометрии. Этот метод может иметь значение в биологии развития и стволовых клеток, а также в регенеративной терапии.
Он также может быть использован для изучения заживления ран и поддержания тканей в эпителиальных тканях. Кости очень маленькие и хрупкие, поэтому обращайтесь с ними осторожно, чтобы не сломать или не потерять кости. Костный мозг относительно стабилен, поэтому вы можете работать медленно и осторожно, чтобы обеспечить надлежащий урожай.
Для начала поместите мышь в емкость объемом 500 миллилитров и добавьте достаточно йода, чтобы покрыть половину мыши. Аккуратно встряхните и встряхните контейнер, чтобы обеспечить тщательное покрытие. Затем смойте деионизированной водой.
Выполните еще одну стирку йодом, а затем две стирки с 70% этанолом. Поместите мышь в капюшон и положите ее на спину на лоток. Возьмитесь за задние лапы и раздвиньте их до тех пор, пока не почувствуется хлопок.
Сделайте сантиметровый разрез на коже мыши возле паховой области. Вставьте закрытые ножницы в разрез и откройте ножницы под кожей, чтобы отделить ее от брюшины. Разрежьте кожу на ноге вокруг бедра, затем срежьте кожу вниз по ноге, чтобы обнажить мышцы и кости.
Перед тем, как отрезать заднюю ногу, пальпируйте тазобедренную кость, чтобы точно направить ножницы и предотвратить порезы бедренной кости, где находится большая часть костного мозга. Затем удалите задние лапы, разрезав вокруг тазобедренного сустава, не разрезая бедренную кость. Поместите конечности в трубку с надписью «Конечности».
Затем удалите мышцы, ткани и жир вдоль одной из конечностей, разрезав ножницами параллельно кости. Затем используйте скальпель, чтобы осторожно удалить оставшийся жир или мышцы, выполняя соскабливающие движения перпендикулярно кости. После правильной очистки кости отделите бедренную и большеберцовую кости в колене.
Затем с помощью скальпеля сделайте надрезы на обоих концах бедренной и большеберцовой костей, где нет видимого костного мозга. Вставьте заранее подготовленный шприц и иглу в кость. Если есть сопротивление, обрежьте конец кости до тех пор, пока сопротивление не перестанет встречаться.
Крепко держите кость над трубкой, меченной костным мозгом, и введите раствор для сбора костного мозга в кость. Затем покрасните костный мозг в трубку. Повторите то же самое для другого конца кости, чтобы собрать остальную часть костного мозга, пока кость не станет полностью белой или пустой.
Используя пустой шприц объемом 10 миллилитров и иглу 20G, разбейте комки костного мозга в трубке, втягивая костный мозг вверх и вниз в шприц от пяти до 10 раз. Добавьте 40-микронный фильтр в чистую 50-миллилитровую центрифужную пробирку и промойте ее одним миллилитром раствора для сбора костного мозга. Процедите костный мозг через фильтр, чтобы удалить оставшиеся комки.
Затем промаркируйте пробирку отфильтрованным костным мозгом. Храните процеженный костный мозг в холодильнике или на льду до использования в тот же день. Центрифугируйте клетки костного мозга при 170 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Пропылесосьте и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендировать клетки в 10 миллилитрах одного буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать в течение четырех минут. Затем добавьте 30 миллилитров фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко, чтобы остановить реакцию буфера лизиса.
Центрифугируйте клетки в течение восьми минут при 170G при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 10-20 миллилитрах окрашивающего буфера. Во-первых, разделите клетки на индивидуально маркированные пробирки в зависимости от используемой панели окрашивания, включая компенсационные контрольные приборы.
Подготовьте неокрашенный контроль и изотопный контроль, чтобы блокировать неспецифическое окрашивание. Для каждой флуоресцентной четверти добавьте один контроль пятна, а также добавьте флуоресценцию минус один контроль в сочетании с оставшимися фтористыми четверками. Затем добавьте антитела в соответствии с рекомендуемым разведением и хорошо перемешайте, щелкнув по дну пробирок.
Предпочтительно использовать EpCAM, конъюгированный с фикоэритрином, для визуализации низких популяций клеток. Инкубировать 30 минут при четырех градусах Цельсия в темноте. После инкубации поднесите пробирки к двухкапюшону BSL и добавьте по одному миллилитру окрашивающего буфера в каждую пробирку.
Затем центрифугируйте пробирки при 170G при четырех градусах Цельсия в течение пяти-10 минут. После центрифугирования поднесите закрытые пробирки к вытяжке BSL two и аспирируйте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу ячейки в одном миллилитре буфера для окрашивания и перемешайте дно пробирок.
Повторите промывку и центрифугирование еще два раза. Наконец, повторно суспендируйте нёбо в 500 микролитрах окрашивающего буфера перед проточной цитометрией. Добавьте DAPI или дискриминатор мертвых клеток в соответствии с рекомендациями производителя.
С помощью этого протокола были визуализированы редкие популяции эпителиальных клеток в костном мозге мышей. От четырех до 5% клеток в костном мозге мыши были EpCAM-положительными, независимо от количества подсчитанных клеток. В образцах костного мозга человека от двух до 5% клеток были EpCAM-положительными.
Кроме того, процент клеток в каждом отдельном доноре был постоянным, поскольку подсчитывалось все больше клеток. В образцах крови мышей менее 0,5% клеток были EpCAM-положительными. В то время как в образцах крови человека это число составляло около 0,3% клеток.
Контрольные образцы показали очень мало ложноположительных EpCAM-положительных клеток. Кроме того, клетки, отсортированные в EpCAM-положительной группе, показали окрашивание на пан-цитокератин. В то время как те, кто был из отрицательной группы EpCAM, не продемонстрировали сигнал цитокератина.
Очень важно поддерживать чистую и стерильную окружающую среду. Это предотвратит загрязнение образца. Существует несколько последующих применений, которые можно использовать на изолированных эпителиальных клетках для определения их функции.
К ним относятся секвенирование РНК, эксперименты по культивированию клеток in vivo и иммунофлуоресцентная микроскопия.
