この技術は、健常人の血液および骨髄中に見出される上皮細胞を単離し、さらなるダウンストリーム分析に使用する再現性のある方法を実証する。この技術は、フローサイトメトリーのアクセシビリティにより、自動循環腫瘍細胞分離の数分の一のコストで上皮細胞の単離を可能にします。この方法は、発生および幹細胞生物学および再生療法に影響を与える可能性があります。
また、上皮組織の創傷治癒や組織維持の研究にも使用できます。骨は非常に小さくて壊れやすいので、骨が折れたり失われたりしないように注意して取り扱ってください。骨髄は比較的安定しているので、適切な収穫を確実にするためにゆっくりと慎重に作業することができます。
まず、マウスを500ミリリットルの容器に入れ、マウスの半分を覆うのに十分なヨウ素を加えます。容器をゆっくりと振って回転させ、完全にカバーします。その後、脱イオン水ですすいでください。
ヨウ素洗浄をもう1回行い、次に70%エタノールで2回洗浄します。マウスをフードに入れ、トレイの背中に置きます。後ろ足をつかみ、ポップが感じられるまで引き離します。
鼠径部近くのマウスの皮膚を1センチ切開します。閉じたハサミを切開部に挿入し、皮膚の下のハサミを開いて腹膜から分離します。太ももの周りの脚の皮膚を切り、次に脚の皮膚を切り開いて筋肉と骨を露出させます。
後ろ足を切る前に、腰の骨を触診してはさみを正確に導き、骨髄の大部分が位置する大腿骨への切断を防ぎます。次に、大腿骨を切断せずに股関節の周りを切断して、後ろ足を取り外します。手足を「手足」というラベルの付いたチューブに入れます。
次に、ハサミを使って骨と平行に切って、片方の手足に沿って筋肉、組織、脂肪を取り除きます。次に、メスを使用して、骨に垂直にこする動作を実行して、残っている脂肪や筋肉を注意深く取り除きます。骨を適切に洗浄した後、膝で大腿骨と脛骨を分離します。
次に、メスを使用して、骨髄が見えない大腿骨と脛骨の両端に切り込みを入れます。あらかじめ用意した注射器と針を骨に挿入します。抵抗がある場合は、抵抗がなくなるまで骨の端を切り取ります。
骨髄とラベル付けされたチューブの上に骨をしっかりと保持し、骨髄採取液を骨に注入します。次に、骨髄をチューブに赤面させます。骨のもう一方の端についても繰り返して、骨が完全に白くなるか空になるまで骨髄の残りの部分を収集します。
空の10ミリリットルの注射器と20Gの針を使用して、注射器内で骨髄を上下に5〜10回引いて、チューブ内の骨髄の塊を壊します。清潔な50ミリリットルの遠沈管に40ミクロンのフィルターを追加し、1ミリリットルの骨髄採取溶液ですすいでください。フィルターを通して骨髄をろ過して、残っている塊を取り除きます。
次に、チューブろ過された骨髄にラベルを付けます。ろ過した骨髄は、同じ日に使用するまで冷蔵庫または氷の上に保管してください。骨髄細胞を170Gで室温で10分間遠心分離します。
上澄み液を掃除機で捨てます。細胞を10ミリリットルの1 x 赤血球溶解バッファーに再懸濁し、4分間インキュベートします。次に、30ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を加えて、溶解バッファーの反応を停止します。
細胞を室温で170Gで8分間遠心分離します。上清を捨て、10〜20ミリリットルの染色バッファーに再懸濁します。まず、使用した染色パネル(補正コントロールを含む)に基づいて、細胞を個別に標識されたチューブに分割します。
非特異的染色をブロックするために、染色されていないコントロールと同位体コントロールを準備します。すべてのフルオラ4について、単一の染色コントロールを追加し、残りのフルオラフォーと組み合わせて蛍光マイナス1コントロールを追加します。次に、推奨希釈率に従って抗体を加え、チューブの底をフリックしてよく混ぜます。
好ましくは、フィコエリスリンに結合したEpCAMを使用して、細胞の低集団を視覚化する。暗闇の中で摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブをBSLの2つのフードに持ち込み、各チューブに1ミリリットルの染色バッファーを追加します。
次に、チューブを摂氏4度で170Gで5〜10分間遠心分離します。遠心分離後、キャップをしたチューブをBSLの2つのフードに持ち込み、上清を吸引します。細胞ペレットを1ミリリットルの染色バッファーに再懸濁し、チューブの底をフリックして混合します。
洗浄と遠心分離をさらに2回繰り返します。最後に、フローサイトメトリーの前に口蓋を500マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁します。DAPIまたは死細胞識別器は、メーカーの推奨に従って追加してください。
このプロトコールを用いて、上皮細胞の稀な集団をマウスの骨髄において可視化した。マウス骨髄の細胞の4〜5%は、カウントされた細胞数に関係なく、EpCAM陽性でした。ヒト骨髄サンプルでは、2〜5%の細胞がEpCAM陽性であった。
また、個々のドナー内の細胞の割合は、徐々により多くの細胞がカウントされるにつれて一貫していました。マウスの血液サンプルでは、0.5%未満の細胞がEpCAM陽性でした。一方、人間の血液サンプルでは、この数は細胞の約0.3%でした。
対照サンプルは、偽陽性のEpCAM陽性細胞をほとんど示さなかった。また、EpCAM陽性群で選別された細胞は、パンサイトケラチンに対する染色を示した。一方、EpCAM陰性群からのものはサイトケラチンシグナルを示さなかった。
清潔で無菌の環境を維持することが最も重要です。これにより、サンプルへの汚染を防ぐことができます。単離された上皮細胞でそれらの機能を決定するために使用できるいくつかの下流アプリケーションがあります。
これらには、RNAシーケンシング、細胞培養in vivo実験、および免疫蛍光顕微鏡法が含まれます。
