Esta técnica demuestra un método reproducible para aislar las células epiteliales que se encuentran en la sangre y la médula ósea de individuos sanos para su uso en el análisis posterior. Esta técnica permite el aislamiento de células epiteliales a una fracción del costo del aislamiento automático de células tumorales circulantes debido a la accesibilidad de la citometría de flujo. Este método puede tener implicaciones en el desarrollo y la biología de las células madre y las terapias regenerativas.
También se puede utilizar para estudiar la cicatrización de heridas y el mantenimiento de tejidos en tejidos epiteliales. Los huesos son muy pequeños y frágiles, así que manéjelos con cuidado para evitar que se rompan o pierdan los huesos. La médula ósea es relativamente estable, por lo que puede trabajar lenta y cuidadosamente para garantizar una cosecha adecuada.
Para comenzar, coloque el mouse en un recipiente de 500 mililitros y agregue suficiente yodo para cubrir la mitad del mouse. Agite suavemente y agite el recipiente para garantizar una cobertura completa. Luego enjuague con agua desionizada.
Realice un lavado más de yodo y luego dos lavados con etanol al 70%. Coloque el ratón en una capucha y colóquelo boca arriba en la bandeja. Agarra las patas traseras y separa hasta que se sienta un estallido.
Haga una incisión de un centímetro en la piel del ratón cerca del área de la ingle. Inserte un par de tijeras cerradas en la incisión y abra las tijeras debajo de la piel para separarla del peritoneo. Corte la piel de la pierna alrededor del muslo, luego corte la piel hacia abajo de la pierna para exponer los músculos y los huesos.
Antes de cortar la pata trasera, palpa el hueso de la cadera para guiar con precisión las tijeras y evitar cortes en el fémur donde se encuentra la mayor parte de la médula ósea. Luego retire las patas traseras cortando alrededor de la articulación de la cadera sin cortar a través del fémur. Coloque las extremidades en un tubo etiquetado como extremidades.
A continuación, retire los músculos, el tejido y la grasa a lo largo de una de las extremidades cortando paralelo al hueso con tijeras. Luego use un bisturí para eliminar cuidadosamente cualquier grasa o músculo restante realizando un movimiento de raspado perpendicular al hueso. Después de limpiar el hueso adecuadamente, separe el fémur y la tibia en la rodilla.
Luego use un bisturí para hacer cortes en ambos extremos del fémur y la tibia donde no hay médula ósea visible. Inserte la jeringa y la aguja preparadas previamente en el hueso. Si hay resistencia, recorte el extremo del hueso hasta que no se encuentre más resistencia.
Sostenga el hueso firmemente por encima del tubo marcado como médula ósea e inyecte la solución de recolección de médula ósea en el hueso. Luego sonrojar la médula ósea en el tubo. Repita para el otro extremo del hueso para recoger el resto de la médula ósea hasta que el hueso aparezca completamente blanco o vacío.
Con una jeringa vacía de 10 mililitros y una aguja de 20 G, rompa los grupos de médula ósea en el tubo extrayendo la médula ósea hacia arriba y hacia abajo en la jeringa de cinco a 10 veces. Agregue un filtro de 40 micras a un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros y enjuáguelo con un mililitro de solución de recolección de médula ósea. Filtre la médula ósea a través del filtro para eliminar cualquier grumo restante.
Luego etiquete el tubo de médula ósea filtrada. Guarde la médula ósea filtrada en un refrigerador o en hielo hasta que la use el mismo día. Centrifugar las células de la médula ósea a 170 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Aspire y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 10 mililitros de un tampón de lisis de glóbulos rojos e incube durante cuatro minutos. Luego agregue 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco para detener la reacción del tampón de lisis.
Centrifugar las células durante ocho minutos a 170 g a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en 10 a 20 mililitros de tampón de tinción. Primero, divida las células en tubos etiquetados individualmente según el panel de tinción utilizado, incluidos los controles de compensación.
Prepare controles no teñidos y controles de isótopos para bloquear la tinción no específica. Por cada fluora cuatro, agregue un solo control de tinción y también agregue fluorescencia menos un control en combinación con los cuatro fluora restantes. A continuación, agregue anticuerpos de acuerdo con la dilución recomendada y mezcle bien moviendo la parte inferior de los tubos.
Preferiblemente use EpCAM conjugado con Ficoeritrina para visualizar poblaciones bajas de células. Incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Después de la incubación, lleve los tubos a la campana BSL de dos campanas y agregue un mililitro de tampón de tinción a cada tubo.
Luego centrifugar los tubos a 170G a cuatro grados centígrados durante cinco a 10 minutos. Después de la centrifugación, lleve los tubos tapados a la campana BSL de dos campanas y aspire el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de tampón de tinción y mueva la parte inferior de los tubos para mezclar.
Repita el lavado y la centrifugación dos veces más. Finalmente, volver a suspender el paladar en 500 microlitros de tampón de tinción antes de la citometría de flujo. Agregue DAPI o discriminador de células muertas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Usando este protocolo se visualizaron poblaciones raras de células epiteliales en la médula ósea de ratones. De cuatro a 5% de las células en la médula ósea murina fueron positivas para EpCAM, independientemente del número de células contadas. En muestras de médula ósea humana, de dos a 5% de las células eran positivas para EpCAM.
Además, el porcentaje de células dentro de cada donante individual fue consistente a medida que se contaron gradualmente más células. En muestras de sangre murinas, menos del 0,5% de las células eran positivas para EpCAM. Mientras que en las muestras de sangre humana este número era de alrededor del 0,3% de las células.
Las muestras de control mostraron muy pocas células falsas positivas para EpCAM positivas. Además, las células clasificadas en el grupo positivo de EpCAM mostraron tinción para la citoqueratina pan. Mientras que los del grupo EpCAM negativo no demostraron la señal de citoqueratina.
Es muy importante mantener un ambiente limpio y estéril. Esto evitará cualquier contaminación de la muestra. Hay varias aplicaciones posteriores que se pueden utilizar en las células epiteliales aisladas para determinar su función.
Estos incluyen secuenciación de ARN, cultivos celulares en experimentos in vivo y microscopía de inmunofluorescencia.
