Questa tecnica dimostra un metodo riproducibile per isolare le cellule epiteliali presenti nel sangue e nel midollo osseo di individui sani da utilizzare per ulteriori analisi a valle. Questa tecnica consente l'isolamento delle cellule epiteliali ad una frazione del costo dell'isolamento automatico delle cellule tumorali circolanti grazie all'accessibilità della citometria a flusso. Questo metodo può avere implicazioni nella biologia dello sviluppo e delle cellule staminali e nelle terapie rigenerative.
Può anche essere usato per studiare la guarigione delle ferite e il mantenimento dei tessuti epiteliali. Le ossa sono molto piccole e fragili, quindi maneggiano con cura per evitare di spezzare o perdere le ossa. Il midollo osseo è relativamente stabile, quindi puoi lavorare lentamente e con attenzione per garantire una corretta raccolta.
Per iniziare, posizionare il mouse in un contenitore da 500 millilitri e aggiungere abbastanza iodio per coprire metà del mouse. Agitare delicatamente e ruotare il contenitore per garantire una copertura completa. Quindi risciacquare con acqua deionizzata.
Eseguire un altro lavaggio con iodio e poi due lavaggi con etanolo al 70%. Metti il mouse in un cappuccio e appoggialo sul retro sul vassoio. Afferrare le zampe posteriori e separarle fino a quando non si sente un colpo.
Fai un'incisione di un centimetro sulla pelle del topo vicino alla zona inguinale. Inserire un paio di forbici chiuse nell'incisione e aprire le forbici sotto la pelle per separarla dal peritoneo. Tagliare la pelle sulla gamba intorno alla coscia, quindi tagliare la pelle lungo la gamba per esporre i muscoli e le ossa.
Prima di tagliare la zampa posteriore, palpare l'osso dell'anca per guidare con precisione le forbici e prevenire tagli al femore dove si trova la maggior parte del midollo osseo. Quindi rimuovere le zampe posteriori tagliando intorno all'articolazione dell'anca senza tagliare il femore. Metti gli arti in un tubo etichettato arti.
Quindi, rimuovere i muscoli, il tessuto e il grasso lungo uno degli arti tagliando parallelamente all'osso usando le forbici. Quindi utilizzare un bisturi per rimuovere con cura qualsiasi grasso o muscolo rimanente eseguendo un movimento raschiante perpendicolare all'osso. Dopo aver pulito correttamente l'osso, separare il femore e la tibia al ginocchio.
Quindi utilizzare un bisturi per effettuare tagli su entrambe le estremità del femore e della tibia dove non c'è midollo osseo visibile. Inserire la siringa pre-preparata e l'ago nell'osso. Se c'è resistenza, tagliare l'estremità dell'osso fino a quando non si riscontra più resistenza.
Tenere l'osso saldamente sopra il tubo marcato midollo osseo e iniettare la soluzione di raccolta del midollo osseo nell'osso. Quindi arrossire il midollo osseo nel tubo. Ripetere per l'altra estremità dell'osso per raccogliere il resto del midollo osseo fino a quando l'osso appare completamente bianco o vuoto.
Utilizzando una siringa vuota da 10 millilitri e un ago da 20 G, rompere i grumi di midollo osseo nel tubo aspirando il midollo osseo su e giù nella siringa da cinque a 10 volte. Aggiungere un filtro da 40 micron a un tubo da centrifuga pulito da 50 millilitri e sciacquarlo con un millilitro di soluzione di raccolta del midollo osseo. Filtrare il midollo osseo attraverso il filtro per rimuovere eventuali grumi rimanenti.
Quindi etichettare il midollo osseo filtrato del tubo. Conservare il midollo osseo filtrato in frigorifero o su ghiaccio fino all'uso nello stesso giorno. Centrifugare le cellule del midollo osseo a 170G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 10 millilitri di un tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per quattro minuti. Quindi aggiungere 30 millilitri di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco per fermare la reazione del tampone di lisi.
Centrifugare le cellule per otto minuti a 170G a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere in 10-20 millilitri di tampone anti-colorante. In primo luogo, dividere le celle in tubi etichettati individualmente in base al pannello di colorazione utilizzato, compresi i controlli di compensazione.
Preparare controlli non colorati e controlli isotopici per bloccare la colorazione non specifica. Per ogni fluora quattro, aggiungere il controllo della singola macchia e aggiungere anche i controlli di fluorescenza meno uno in combinazione con i restanti quattro fluora. Quindi, aggiungere gli anticorpi secondo la diluizione raccomandata e mescolare bene facendo scorrere il fondo dei tubi.
Utilizzare preferibilmente EpCAM coniugato a Phycoerythrin per visualizzare basse popolazioni di cellule. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Dopo l'incubazione, portare i tubi al bicappuccio BSL e aggiungere un millilitro di tampone colorante a ciascun tubo.
Quindi centrifugare i tubi a 170G a quattro gradi Celsius per cinque a 10 minuti. Dopo la centrifugazione, portare i tubi tappati alla due cappe BSL e aspirare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone colorante e scorrere il fondo dei tubi per mescolare.
Ripetere il lavaggio e la centrifugazione altre due volte. Infine, risospendere il palato in 500 microlitri di tampone colorante prima della citometria a flusso. Aggiungere DAPI o discriminatore a cellule morte secondo le raccomandazioni del produttore.
Utilizzando questo protocollo sono state visualizzate rare popolazioni di cellule epiteliali nel midollo osseo dei topi. Dal quattro al 5% delle cellule nel midollo osseo murino erano EpCAM positive, indipendentemente dal numero di cellule contate. Nei campioni di midollo osseo umano da due a 5% delle cellule erano EpCAM positive.
Inoltre, la percentuale di cellule all'interno di ogni singolo donatore era coerente man mano che venivano contate più cellule in modo incrementale. Nei campioni di sangue murino, meno dello 0,5% delle cellule era EpCAM positivo. Mentre nei campioni di sangue umano questo numero era di circa lo 0,3% delle cellule.
I campioni di controllo hanno mostrato pochissime cellule EpCAM positive false. Inoltre, le cellule ordinate nel gruppo positivo EpCAM hanno mostrato colorazione per la citocheratina pan. Mentre quelli del gruppo EpCAM negativo non hanno dimostrato il segnale della citocheratina.
È molto importante mantenere un ambiente pulito e sterile. Ciò impedirà qualsiasi contaminazione al campione. Esistono diverse applicazioni a valle che possono essere utilizzate sulle cellule epiteliali isolate per determinarne la funzione.
Questi includono il sequenziamento dell'RNA, esperimenti di coltura cellulare in vivo e microscopia a immunofluorescenza.
