Diese Technik demonstriert eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Epithelzellen, die sich im Blut und Knochenmark gesunder Personen befinden, um sie für weitere nachgelagerte Analysen zu verwenden. Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Epithelzellen zu einem Bruchteil der Kosten der automatischen Isolierung zirkulierender Tumorzellen aufgrund der Zugänglichkeit der Durchflusszytometrie. Diese Methode kann Auswirkungen auf die Entwicklungs- und Stammzellbiologie sowie auf regenerative Therapien haben.
Es kann auch verwendet werden, um die Wundheilung und den Gewebeerhalt in Epithelgeweben zu untersuchen. Die Knochen sind sehr klein und zerbrechlich, daher vorsichtig behandeln, um ein Brechen oder Verlieren der Knochen zu vermeiden. Das Knochenmark ist relativ stabil, so dass Sie langsam und vorsichtig arbeiten können, um eine ordnungsgemäße Ernte zu gewährleisten.
Legen Sie die Maus zunächst in einen 500-Milliliter-Behälter und fügen Sie so viel Jod hinzu, dass die Hälfte der Maus bedeckt ist. Schütteln und schwenken Sie den Behälter vorsichtig, um eine gründliche Abdeckung zu gewährleisten. Anschließend mit deionisiertem Wasser abspülen.
Führen Sie eine weitere Jodwäsche und dann zwei Wäschen mit 70%igem Ethanol durch. Legen Sie die Maus in eine Haube und legen Sie sie auf den Rücken auf das Tablett. Greife die Hinterbeine und ziehe sie auseinander, bis ein Knacken zu spüren ist.
Machen Sie einen Ein-Zentimeter-Schnitt auf der Haut der Maus in der Nähe der Leistengegend. Führen Sie eine geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie die Schere unter der Haut, um sie vom Bauchfell zu trennen. Schneiden Sie die Haut am Bein um den Oberschenkel herum und schneiden Sie dann die Haut am Bein ab, um die Muskeln und Knochen freizulegen.
Bevor Sie das Hinterbein abschneiden, tasten Sie den Hüftknochen ab, um die Schere genau zu führen und Schnitte am Oberschenkelknochen zu vermeiden, wo sich der größte Teil des Knochenmarks befindet. Entfernen Sie dann die Hinterbeine, indem Sie um das Hüftgelenk herum schneiden, ohne den Oberschenkelknochen zu durchtrennen. Legen Sie die Gliedmaßen in ein Röhrchen, das mit Gliedmaßen beschriftet ist.
Entfernen Sie als Nächstes die Muskeln, das Gewebe und das Fett entlang einer der Gliedmaßen, indem Sie mit einer Schere parallel zum Knochen schneiden. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um verbleibendes Fett oder Muskeln vorsichtig zu entfernen, indem Sie eine Schabenbewegung senkrecht zum Knochen ausführen. Nachdem Sie den Knochen gründlich gereinigt haben, trennen Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein am Knie.
Verwenden Sie dann ein Skalpell, um Schnitte an beiden Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins zu machen, wo kein sichtbares Knochenmark vorhanden ist. Führen Sie die vorbereitete Spritze und Nadel in den Knochen ein. Wenn ein Widerstand vorhanden ist, kürzen Sie das Ende des Knochens, bis kein Widerstand mehr auftritt.
Halten Sie den Knochen fest über dem mit Knochenmark beschrifteten Röhrchen und injizieren Sie die Knochenmarkentnahmelösung in den Knochen. Dann das Knochenmark in die Tube ausröten. Wiederholen Sie dies für das andere Ende des Knochens, um den Rest des Knochenmarks zu sammeln, bis der Knochen vollständig weiß oder leer erscheint.
Brechen Sie mit einer leeren 10-Milliliter-Spritze und einer 20-G-Nadel die Knochenmarkklumpen im Röhrchen auf, indem Sie das Knochenmark fünf- bis 10-mal in der Spritze auf und ab ziehen. Geben Sie einen 40-Mikron-Filter in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und spülen Sie es mit einem Milliliter Knochenmark-Erntelösung aus. Filtern Sie das Knochenmark durch den Filter, um verbleibende Klumpen zu entfernen.
Beschriften Sie dann das röhrchenfiltrierte Knochenmark. Bewahren Sie das gefilterte Knochenmark bis zur Verwendung am selben Tag im Kühlschrank oder auf Eis auf. Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen bei 170 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Saugen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern eines x Lysepuffers für rote Blutkörperchen und inkubieren Sie sie vier Minuten lang. Fügen Sie dann 30 Milliliter der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco hinzu, um die Reaktion des Lysepuffers zu stoppen.
Zentrifugieren Sie die Zellen acht Minuten lang bei 170 G bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn in 10 bis 20 Milliliter Färbepuffer. Teilen Sie zunächst die Zellen in individuell markierte Röhrchen auf, basierend auf dem verwendeten Färbepanel, einschließlich Kompensationskontrollen.
Bereiten Sie ungefärbte Kontrollen und Isotopenkontrollen vor, um unspezifische Färbungen zu blockieren. Fügen Sie für jede Fluora-Vier-Färbung eine Einzelfärbungskontrolle hinzu und fügen Sie auch Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen in Kombination mit den verbleibenden Fluora-Vieren hinzu. Als nächstes fügen Sie Antikörper gemäß der empfohlenen Verdünnung hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie den Boden der Röhrchen schnippen.
Verwenden Sie vorzugsweise EpCAM, das an Phycoerythrin konjugiert ist, um niedrige Zellpopulationen sichtbar zu machen. 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Bringen Sie die Röhrchen nach der Inkubation in die BSL-Zweierhaube und geben Sie einen Milliliter Färbepuffer in jedes Röhrchen.
Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 170 G bei vier Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten. Bringen Sie nach dem Zentrifugieren die verschlossenen Röhrchen zur BSL-Zweierhaube und saugen Sie den Überstand ab. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem Milliliter Färbepuffer und schnippen Sie den Boden der Röhrchen zum Mischen.
Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren noch zweimal. Zum Schluss wird der Gaumen vor der Durchflusszytometrie in 500 Mikrolitern Färbepuffer resuspendiert. Fügen Sie DAPI oder Dead-Cell-Diskriminator gemäß den Empfehlungen des Herstellers hinzu.
Mit Hilfe dieses Protokolls wurden seltene Populationen von Epithelzellen im Knochenmark von Mäusen sichtbar gemacht. Vier bis 5 % der Zellen im murinen Knochenmark waren EpCAM-positiv, unabhängig von der Anzahl der gezählten Zellen. In humanen Knochenmarkproben waren zwei bis 5% der Zellen EpCAM-positiv.
Auch der Prozentsatz der Zellen innerhalb jedes einzelnen Spenders war konsistent, da inkrementell mehr Zellen gezählt wurden. In murinen Blutproben waren weniger als 0,5 % der Zellen EpCAM-positiv. In menschlichen Blutproben lag diese Zahl bei etwa 0,3 % der Zellen.
Die Kontrollproben zeigten nur sehr wenige falsch positive EpCAM-positive Zellen. Weiterhin zeigten die Zellen, die in der EpCAM-positiven Gruppe sortiert waren, eine Färbung für Pan-Zytokeratin. Diejenigen aus der EpCAM-negativen Gruppe zeigten das Zytokeratin-Signal nicht.
Es ist am wichtigsten, eine saubere und sterile Umgebung zu erhalten. Dadurch wird eine Kontamination der Probe verhindert. Es gibt mehrere nachgeschaltete Anwendungen, die auf die isolierten Epithelzellen angewendet werden können, um deren Funktion zu bestimmen.
Dazu gehören RNA-Sequenzierung, Zellkultur-in-vivo-Experimente und Immunfluoreszenzmikroskopie.
