Esta técnica demonstra um método reprodutível para isolar células epiteliais encontradas no sangue e na medula óssea de indivíduos saudáveis para uso em análises posteriores a jusante. Esta técnica permite o isolamento de células epiteliais a uma fração do custo do isolamento automático de células tumorais circulantes devido à acessibilidade da citometria de fluxo. Este método pode ter implicações na biologia do desenvolvimento e de células-tronco e terapias regenerativas.
Também pode ser usado para estudar a cicatrização de feridas e manutenção tecidual em tecidos epiteliais. Os ossos são muito pequenos e frágeis, por isso manuseie com cuidado para evitar estalar ou perder os ossos. A medula óssea é relativamente estável, então você pode trabalhar lenta e cuidadosamente para garantir a colheita adequada.
Para começar, coloque o mouse em um recipiente de 500 mililitros e adicione iodo suficiente para cobrir metade do mouse. Agite suavemente e gire o recipiente para garantir uma cobertura completa. Em seguida, enxágue com água deionizada.
Realizar mais uma lavagem com iodo e depois duas lavagens com etanol 70%. Coloque o mouse em um capuz e coloque-o de costas na bandeja. Pegue as patas traseiras e afaste-as até que um estalo seja sentido.
Faça uma incisão de um centímetro na pele do rato perto da área da virilha. Insira uma tesoura fechada na incisão e abra a tesoura sob a pele para separá-la do peritônio. Corte a pele da perna ao redor da coxa, em seguida, corte a pele para baixo da perna para expor os músculos e ossos.
Antes de cortar a pata traseira, palpe o osso do quadril para guiar com precisão a tesoura e evitar cortes no fêmur, onde a maior parte da medula óssea está localizada. Em seguida, remova as patas traseiras cortando ao redor da articulação do quadril sem cortar o fêmur. Coloque os membros em um tubo rotulado membros.
Em seguida, remova os músculos, tecido e gordura ao longo de um dos membros, cortando paralelamente ao osso usando uma tesoura. Em seguida, use um bisturi para remover cuidadosamente qualquer gordura ou músculo restante, realizando um movimento de raspagem perpendicular ao osso. Depois de limpar o osso corretamente, separe o fêmur e a tíbia no joelho.
Em seguida, use um bisturi para fazer cortes em ambas as extremidades do fêmur e tíbia, onde não há medula óssea visível. Insira a seringa e a agulha pré-preparadas no osso. Se houver resistência, corte a extremidade do osso até que não haja mais resistência.
Segure o osso firmemente acima da medula óssea marcada com o tubo e injete a solução de colheita de medula óssea no osso. Em seguida, core a medula óssea para dentro do tubo. Repita para a outra extremidade do osso para coletar o resto da medula óssea até que o osso pareça completamente branco ou vazio.
Usando uma seringa vazia de 10 mililitros e uma agulha de 20G, quebre os aglomerados de medula óssea no tubo puxando a medula óssea para cima e para baixo na seringa cinco a 10 vezes. Adicione um filtro de 40 mícrons a um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros e lave-o com um mililitro de solução de colheita de medula óssea. Filtre a medula óssea através do filtro para remover quaisquer aglomerados restantes.
Em seguida, rotule a medula óssea filtrada do tubo. Guarde a medula óssea filtrada em geladeira ou no gelo até o uso no mesmo dia. Centrifugar as células da medula óssea a 170G por 10 minutos à temperatura ambiente.
Aspirar e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 10 mililitros de um tampão de lise de hemácias e incubar por quatro minutos. Em seguida, adicione 30 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco para interromper a reação do tampão de lise.
Centrifugar as células durante oito minutos a 170G à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda em 10 a 20 mililitros de tampão de coloração. Primeiro, divida as células em tubos marcados individualmente com base no painel de coloração usado, incluindo controles de compensação.
Prepare controles sem manchas e controles de isótopos para bloquear colorações não específicas. Para cada quatro fluora, adicione um único controle de mancha e também adicione fluorescência menos um controle em combinação com os quatro fluora restantes. Em seguida, adicione anticorpos de acordo com a diluição recomendada e misture bem mexendo no fundo dos tubos.
Preferencialmente use EpCAM conjugado à Ficoeritrina para visualizar baixas populações de células. Incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Após a incubação, leve os tubos para a coifa BSL dois e adicione um mililitro de tampão de coloração a cada tubo.
Em seguida, centrifugar os tubos a 170G a quatro graus Celsius por cinco a 10 minutos. Após a centrifugação, leve os tubos tampados para o exaustor BSL dois e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet de célula em um mililitro de tampão de coloração e agite o fundo dos tubos para misturar.
Repita a lavagem e a centrifugação mais duas vezes. Finalmente, ressuspender o palato em 500 microlitros de tampão corante antes da citometria de fluxo. Adicionar DAPI ou discriminador de células mortas de acordo com as recomendações do fabricante.
Usando este protocolo, populações raras de células epiteliais foram visualizadas na medula óssea de camundongos. Quatro a 5% das células da medula óssea murina foram positivas para EpCAM, independentemente do número de células contadas. Em amostras de medula óssea humana, duas a 5% das células foram positivas para EpCAM.
Além disso, a porcentagem de células dentro de cada doador individual foi consistente à medida que mais células foram contadas incrementalmente. Em amostras de sangue murino, menos de 0,5% das células foram positivas para EpCAM. Já nas amostras de sangue humano esse número foi de cerca de 0,3% das células.
As amostras controle apresentaram pouquíssimas células EpCAM positivas para falso-positivo. Além disso, as células classificadas no grupo positivo para EpCAM mostraram coloração para pan citoqueratina. Enquanto os do grupo EpCAM negativo não demonstraram o sinal da citoqueratina.
É mais importante manter um ambiente limpo e estéril. Isso evitará qualquer contaminação para a amostra. Existem várias aplicações a jusante que podem ser usadas nas células epiteliais isoladas para determinar sua função.
Estes incluem sequenciamento de RNA, experimentos de cultura de células in vivo e microscopia de imunofluorescência.
