טכניקה זו מדגימה שיטה הניתנת לשחזור לבידוד תאי אפיתל הנמצאים בדם ובמח העצם של אנשים בריאים לשימוש לניתוח נוסף במורד הזרם. טכניקה זו מאפשרת בידוד של תאי אפיתל בשבריר מהעלות של בידוד אוטומטי של תאי גידול במחזור בגלל הנגישות של ציטומטריית זרימה. לשיטה זו יכולות להיות השלכות בביולוגיה התפתחותית ובביולוגיה של תאי גזע ובטיפולים רגנרטיביים.
זה יכול לשמש גם כדי ללמוד ריפוי פצעים ותחזוקת רקמות ברקמות אפיתל. העצמות קטנות מאוד ושבריריות ולכן יש לטפל בזהירות כדי למנוע הצמדה או איבוד של העצמות. מח העצם יציב יחסית, כך שניתן לעבוד לאט ובזהירות כדי להבטיח קציר תקין.
כדי להתחיל, מניחים את העכבר במיכל של 500 מיליליטר ומוסיפים מספיק יוד כדי לכסות מחצית מהעכבר. נערו וערבלו בעדינות את המיכל כדי להבטיח כיסוי יסודי. לאחר מכן יש לשטוף במים נטולי יונים.
בצע שטיפת יוד אחת נוספת ולאחר מכן שתי שטיפות עם 70% אתנול. הכנס את העכבר למכסה מנוע והנח אותו על גבו על המגש. תפוס את הרגליים האחוריות ומשוך אותן זו מזו עד שמורגש פיצוץ.
בצע חתך של סנטימטר אחד על העור של העכבר ליד אזור המפשעה. הכנס זוג מספריים סגור לתוך החתך ופתח את המספריים מתחת לעור כדי להפריד אותו מהצפק. חותכים את העור ברגל סביב הירך, ואז חותכים את העור במורד הרגל כדי לחשוף את השרירים והעצמות.
לפני חיתוך הרגל האחורית, יש למשש את עצם הירך כדי לכוון במדויק את המספריים ולמנוע חתכים בעצם הירך שבה נמצא רוב מח העצם. לאחר מכן הסר את הרגליים האחוריות על ידי חיתוך סביב מפרק הירך מבלי לחתוך דרך עצם הירך. הניחו את הגפיים בצינור המסומן בגפיים.
לאחר מכן, הסר את השרירים, הרקמה והשומן לאורך אחת הגפיים על ידי חיתוך במקביל לעצם באמצעות מספריים. לאחר מכן השתמש באזמל כדי להסיר בזהירות את כל השומן או השריר שנותרו על ידי ביצוע תנועת גירוד בניצב לעצם. לאחר ניקוי נכון של העצם, יש להפריד בין עצם הירך לעצם השוקה בברך.
לאחר מכן השתמש באזמל כדי לבצע חתכים בשני הקצוות של עצם הירך והשוקה, היכן שאין מח עצם גלוי. הכנס את המזרק והמחט שהוכנו מראש לתוך העצם. אם יש התנגדות, חותכים את קצה העצם עד שלא תיתקלו בהתנגדות נוספת.
החזיקו את העצם בחוזקה מעל הצינור המסומן כמח עצם והזריקו את תמיסת קצירת מח העצם לתוך העצם. לאחר מכן לשטוף את מח העצם לתוך הצינור. חזור על הפעולה עבור הקצה השני של העצם כדי לאסוף את שאר מח העצם עד שהעצם נראית לבנה לחלוטין או ריקה.
באמצעות מזרק ריק של 10 מיליליטר ומחט 20G, שוברים את גושי מח העצם בצינור על ידי משיכת מח העצם למעלה ולמטה במזרק חמש עד 10 פעמים. הוסף מסנן 40 מיקרון לצינור צנטריפוגה נקי של 50 מיליליטר ושטוף אותו במיליליטר אחד של תמיסת קציר מח עצם. סנן את מח העצם דרך המסנן כדי להסיר את הגושים שנותרו.
לאחר מכן תייגו את מח העצם המסונן בצינור. אחסנו את מח העצם המסונן במקרר או על קרח עד לשימוש באותו היום. צנטריפוגה את תאי מח העצם ב 170G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לשאוב ולהשליך את הסופר-נטנט. להשעות מחדש את התאים ב 10 מיליליטר של אחד x חיץ דם אדום ליזה לדגור במשך ארבע דקות. לאחר מכן הוסיפו 30 מיליליטר של מלח חוצץ פוספט של דולבקו כדי לעצור את התגובה של חיץ הליזיס.
צנטריפוגו את התאים למשך שמונה דקות בטמפרטורה של 170 גרם בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש ב-10 עד 20 מיליליטר של חיץ מכתים. ראשית, חלקו את התאים לצינורות המסומנים בנפרד בהתבסס על לוח הצביעה בו נעשה שימוש, כולל בקרות פיצוי.
הכינו בקרות לא מוכתמות ובקרי איזוטופים כדי לחסום כתמים לא ספציפיים. עבור כל פלואורה ארבע, הוסף בקרת כתמים אחת וגם הוסף פלואורסצנטיות פחות פקד אחד בשילוב עם ארבע פלואורה הנותרות. לאחר מכן, מוסיפים נוגדנים בהתאם לדילול המומלץ ומערבבים היטב על ידי הבהוב בתחתית הצינורות.
עדיף להשתמש ב-EpCAM מצומד לפיקוריתרין כדי לדמיין אוכלוסיות נמוכות של תאים. דוגרים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הדגירה, הביאו את הצינורות למכסה המנוע של BSL והוסיפו מיליליטר אחד של חיץ מכתים לכל צינור.
לאחר מכן צנטריפוגו את הצינורות ב-170G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הביאו את הצינורות המכוסים למכסה המנוע השני של BSL ושאפו את הסופרנטנט. השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של חיץ מכתים והחלק את תחתית הצינורות כדי לערבב.
יש לחזור על השטיפה והצנטריפוגה פעמיים נוספות. לבסוף, להשהות מחדש את החיך ב 500 מיקרוליטר של חיץ מכתים לפני ציטומטריית זרימה. הוסף DAPI או מפלה תאים מתים בהתאם להמלצות היצרן.
באמצעות פרוטוקול זה הודגמו אוכלוסיות נדירות של תאי אפיתל במח העצם של עכברים. ארבעה עד 5% מהתאים במח העצם היו חיוביים ל-EpCAM, ללא קשר למספר התאים שנספרו. בדגימות מח עצם אנושיות שניים עד 5% מהתאים היו חיוביים ל-EpCAM.
כמו כן, אחוז התאים בתוך כל תורם בודד היה עקבי ככל שנספרו בהדרגה יותר תאים. בדגימות דם מורין, פחות מ-0.5% מהתאים היו חיוביים ל-EpCAM. בעוד שבדגימות דם אנושיות מספר זה היה סביב 0.3% מהתאים.
דגימות הביקורת הראו מעט מאוד תאים חיוביים כוזבים של EpCAM. יתר על כן, התאים שמוינו בקבוצה החיובית EpCAM הראו צביעה עבור פאן ציטוקרטין. בעוד שאלו מהקבוצה השלילית EpCAM לא הדגימו את אות הציטוקרטין.
חשוב ביותר לשמור על סביבה נקייה וסטרילית. זה ימנע כל זיהום לדגימה. ישנם מספר יישומים במורד הזרם שניתן להשתמש בהם על תאי אפיתל מבודדים כדי לקבוע את תפקודם.
אלה כוללים ריצוף RNA, ניסויים בתרבית תאים in vivo ומיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי.
