EpCAM和细胞角蛋白在正常人和小鼠血液和骨髓中表达上皮细胞的证据

该技术展示了一种可重复的方法，可以分离健康个体血液和骨髓中发现的上皮细胞，以用于进一步的下游分析。由于流式细胞术的可及性，该技术允许以自动循环肿瘤细胞分离的一小部分成本分离上皮细胞。这种方法可能对发育和干细胞生物学以及再生疗法产生影响。

它还可用于研究上皮组织中的伤口愈合和组织维护。骨头非常小且脆弱，因此请小心处理以防止骨头折断或丢失。骨髓相对稳定，因此您可以缓慢而小心地工作以确保适当的收获。

首先，将鼠标放入500毫升的容器中，并添加足够的碘以覆盖鼠标的一半。轻轻摇晃并旋转容器以确保彻底覆盖。然后用去离子水冲洗。

再进行一次碘洗涤，然后用70%乙醇洗涤两次。将鼠标放在引擎盖中，然后将其仰卧放在托盘上。抓住后腿并将它们拉开，直到感觉到爆裂声。

在腹股沟区域附近的小鼠皮肤上做一个一厘米的切口。将一把封闭的剪刀插入切口，并在皮肤下打开剪刀以将其与腹膜分开。在大腿周围切开腿上的皮肤，然后将腿部的皮肤切开，露出肌肉和骨骼。

在切割后腿之前，触诊髋骨以准确引导剪刀并防止大部分骨髓所在的股骨被割伤。然后通过切开髋关节而不切开股骨来移除后腿。将四肢放入标有四肢的管中。

接下来，通过使用剪刀平行于骨骼切割来去除沿其中一条肢体的肌肉、组织和脂肪。然后使用手术刀通过垂直于骨骼的刮擦动作小心地去除任何剩余的脂肪或肌肉。正确清洁骨骼后，将膝盖处的股骨和胫骨分开。

然后用手术刀在没有可见骨髓的股骨和胫骨两端切开。将预先准备好的注射器和针头插入骨头。如果有阻力，修剪骨头末端，直到不再遇到阻力。

将骨牢牢地保持在标记骨髓的管上方，并将骨髓收获溶液注射到骨中。然后将骨髓腮红到管中。对骨骼的另一端重复此操作以收集其余的骨髓，直到骨骼看起来完全白色或空洞。

使用空的10毫升注射器和20G针头，通过在注射器中上下抽取骨髓5至10次来打破管中的骨髓团块。将40微米过滤器加入干净的50毫升离心管中，并用一毫升骨髓收获溶液冲洗。通过过滤器过滤骨髓以去除任何剩余的团块。

然后标记管过滤的骨髓。将过滤后的骨髓存放在冰箱或冰上，直到当天使用。在室温下以170G离心骨髓细胞10分钟。

抽真空并弃去上清液。将细胞重新悬浮在10毫升一个x红细胞裂解缓冲液中，孵育四分钟。然后加入30毫升Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水以停止裂解缓冲液的反应。

在室温下以170G离心细胞8分钟。弃去上清液并重新悬浮在10至20毫升染色缓冲液中。首先，根据所使用的染色面板将细胞分成单独标记的管中，包括补偿对照。

制备未染色质控品和同位素质控品以阻断非特异性染色。对于每四色氟，添加单染色对照，并与剩余的四色氟对照组合添加荧光减一对照。接下来，根据推荐的稀释度添加抗体，并通过轻弹试管底部充分混合。

优选使用与藻红蛋白偶联的EpCAM来可视化低细胞群。在黑暗中在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育后，将试管带到BSL两个罩中，并向每个试管中加入一毫升染色缓冲液。

然后将试管以 170G 在 4 摄氏度下离心 5 到 10 分钟。离心后，将带盖的管带到BSL两个罩中并吸出上清液。将细胞沉淀重新悬浮在一毫升染色缓冲液中，并轻弹试管底部进行混合。

重复洗涤和离心两次。最后，在流式细胞术前将上颚重新悬浮在500微升染色缓冲液中。根据制造商的建议添加 DAPI 或死细胞鉴别器。

使用该协议在小鼠的骨髓中可视化罕见的上皮细胞群。小鼠骨髓中4%至5%的细胞为EpCAM阳性，无论计数的细胞数量如何。在人类骨髓样本中，2%至5%的细胞为EpCAM阳性。

此外，每个供体内的细胞百分比是一致的，因为计数的细胞越来越多。在小鼠血液样本中，不到0.5%的细胞为EpCAM阳性。而在人类血液样本中，这个数字约为细胞的0.3%。

对照样品显示很少的假阳性EpCAM阳性细胞。此外，在EpCAM阳性组中分选的细胞显示出泛细胞角蛋白染色。而来自EpCAM阴性组的人没有表现出细胞角蛋白信号。

最重要的是保持清洁和无菌的环境。这将防止对样品的任何污染。有几种下游应用可用于分离的上皮细胞以确定其功能。

这些包括RNA测序，细胞培养体内实验和免疫荧光显微镜。