Cette technique démontre une méthode reproductible pour isoler les cellules épithéliales trouvées dans le sang et la moelle osseuse d’individus sains à utiliser pour une analyse ultérieure en aval. Cette technique permet d’isoler les cellules épithéliales à une fraction du coût de l’isolement automatique des cellules tumorales circulantes en raison de l’accessibilité de la cytométrie en flux. Cette méthode peut avoir des implications en biologie du développement et des cellules souches et en thérapies régénératives.
Il peut également être utilisé pour étudier la cicatrisation des plaies et le maintien des tissus épithéliaux. Les os sont très petits et fragiles, alors manipulez-les avec soin pour éviter de casser ou de perdre les os. La moelle osseuse est relativement stable, vous pouvez donc travailler lentement et soigneusement pour assurer une bonne récolte.
Pour commencer, placez la souris dans un récipient de 500 millilitres et ajoutez suffisamment d’iode pour couvrir la moitié de la souris. Secouez doucement et agitez le récipient pour assurer une couverture complète. Puis rincer à l’eau désionisée.
Effectuez un autre lavage à l’iode, puis deux lavages avec de l’éthanol à 70%. Placez la souris dans un capot et posez-la sur le dos sur le plateau. Saisissez les pattes postérieures et écartez-les jusqu’à ce qu’un pop se fasse sentir.
Faites une incision d’un centimètre sur la peau de la souris près de la région de l’aine. Insérez une paire de ciseaux fermée dans l’incision et ouvrez les ciseaux sous la peau pour la séparer du péritoine. Coupez la peau de la jambe autour de la cuisse, puis coupez la peau le long de la jambe pour exposer les muscles et les os.
Avant de couper la patte postérieure, palper l’os de la hanche pour guider avec précision les ciseaux et éviter les coupures au fémur où se trouve la majeure partie de la moelle osseuse. Ensuite, retirez les pattes postérieures en coupant autour de l’articulation de la hanche sans couper à travers le fémur. Placez les membres dans un tube étiqueté membres.
Ensuite, retirez les muscles, les tissus et la graisse le long de l’un des membres en coupant parallèlement à l’os à l’aide de ciseaux. Ensuite, utilisez un scalpel pour enlever soigneusement toute graisse ou muscle restant en effectuant un mouvement de grattage perpendiculaire à l’os. Après avoir nettoyé l’os correctement, séparez le fémur et le tibia au niveau du genou.
Ensuite, utilisez un scalpel pour faire des coupures aux deux extrémités du fémur et du tibia où il n’y a pas de moelle osseuse visible. Insérez la seringue et l’aiguille pré-préparées dans l’os. S’il y a résistance, coupez l’extrémité de l’os jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de résistance.
Tenez fermement l’os au-dessus du tube marqué de moelle osseuse et injectez la solution de prélèvement de la moelle osseuse dans l’os. Ensuite, rougir la moelle osseuse dans le tube. Répétez l’opération à l’autre extrémité de l’os pour recueillir le reste de la moelle osseuse jusqu’à ce que l’os apparaisse complètement blanc ou vide.
À l’aide d’une seringue vide de 10 millilitres et d’une aiguille de 20 G, cassez les amas de moelle osseuse dans le tube en aspirant la moelle osseuse de haut en bas dans la seringue cinq à 10 fois. Ajoutez un filtre de 40 microns à un tube centrifuge propre de 50 millilitres et rincez-le avec un millilitre de solution de récolte de moelle osseuse. Filtrer la moelle osseuse à travers le filtre pour enlever les touffes restantes.
Ensuite, étiquetez la moelle osseuse filtrée par tube. Conservez la moelle osseuse filtrée au réfrigérateur ou sur de la glace jusqu’à utilisation le jour même. Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 170G pendant 10 minutes à température ambiante.
Passez l’aspirateur et jetez le surnageant. Re-suspendre les cellules dans 10 millilitres d’un x tampon de lyse des globules rouges et incuber pendant quatre minutes. Ajoutez ensuite 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco pour arrêter la réaction du tampon de lyse.
Centrifuger les cellules pendant huit minutes à 170G à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 10 à 20 millilitres de tampon de coloration. Tout d’abord, divisez les cellules en tubes étiquetés individuellement en fonction du panneau de coloration utilisé, y compris les contrôles de compensation.
Préparer des témoins non colorés et des isotopes pour bloquer les colorations non spécifiques. Pour chaque fluor quatre, ajoutez un seul contrôle de tache et ajoutez également des contrôles de fluorescence moins un en combinaison avec les quatre fluor restants. Ensuite, ajoutez des anticorps selon la dilution recommandée et mélangez bien en agitant le fond des tubes.
Utilisez de préférence de l’EpCAM conjugué à la phycoérythrine pour visualiser de faibles populations de cellules. Incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Après l’incubation, amenez les tubes dans le BSL deux hottes et ajoutez un millilitre de tampon de coloration à chaque tube.
Ensuite, centrifugez les tubes à 170G à quatre degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes. Après centrifugation, amener les tubes bouchés au capot BSL deux et aspirer le surnageant. Re-suspendez la pastille de cellule dans un millilitre de tampon de coloration et agitez le fond des tubes pour mélanger.
Répétez le lavage et la centrifugation deux fois de plus. Enfin, re-suspendre le palais dans 500 microlitres de tampon de coloration avant cytométrie en flux. Ajoutez un DAPI ou un discriminateur de cellules mortes selon les recommandations du fabricant.
En utilisant ce protocole, des populations rares de cellules épithéliales ont été visualisées dans la moelle osseuse de souris. Quatre à 5 % des cellules de la moelle osseuse murine étaient positives à l’EpCAM, quel que soit le nombre de cellules comptées. Dans les échantillons de moelle osseuse humaine, deux à 5% des cellules étaient positives à l’EpCAM.
De plus, le pourcentage de cellules dans chaque donneur individuel était cohérent à mesure que davantage de cellules étaient comptées. Dans les échantillons de sang murin, moins de 0,5% des cellules étaient positives à l’EpCAM. Alors que dans les échantillons de sang humain, ce nombre était d’environ 0,3% des cellules.
Les échantillons témoins ont montré très peu de cellules EpCAM faussement positives positives. De plus, les cellules triées dans le groupe positif à l’EpCAM ont montré une coloration pour la pancytokératine. Alors que ceux du groupe EpCAM négatif n’ont pas démontré le signal de cytokératine.
Il est très important de maintenir un environnement propre et stérile. Cela permettra d’éviter toute contamination de l’échantillon. Il existe plusieurs applications en aval qui peuvent être utilisées sur les cellules épithéliales isolées pour déterminer leur fonction.
Il s’agit notamment du séquençage de l’ARN, des expériences in vivo de culture cellulaire et de la microscopie par immunofluorescence.
