Bu teknik, sağlıklı bireylerin kanında ve kemik iliğinde bulunan epitel hücrelerini daha fazla aşağı akış analizi için kullanmak üzere izole etmek için tekrarlanabilir bir yöntem göstermektedir. Bu teknik, akış sitometrisinin erişilebilirliği nedeniyle epitel hücrelerinin otomatik dolaşımdaki tümör hücresi izolasyonu maliyetinin bir kısmında izole edilmesine izin verir. Bu yöntemin gelişimsel ve kök hücre biyolojisinde ve rejeneratif tedavilerde etkileri olabilir.
Ayrıca epitel dokularında yara iyileşmesi ve doku bakımını incelemek için de kullanılabilir. Kemikler çok küçük ve kırılgandır, bu nedenle kemiklerin kopmasını veya kaybolmasını önlemek için dikkatli kullanın. Kemik iliği nispeten kararlıdır, bu nedenle uygun hasadı sağlamak için yavaş ve dikkatli bir şekilde çalışabilirsiniz.
Başlamak için, fareyi 500 mililitrelik bir kaba yerleştirin ve farenin yarısını kaplayacak kadar iyot ekleyin. Tam bir kapsama alanı sağlamak için kabı yavaşça sallayın ve döndürün. Daha sonra deiyonize su ile durulayın.
Bir iyot yıkama daha yapın ve% 70 etanol ile iki yıkama yapın. Fareyi bir başlığa yerleştirin ve tepsiye sırt üstü koyun. Arka ayakları tutun ve bir pop hissedilene kadar birbirinden ayırın.
Kasık bölgesine yakın farenin derisinde bir santimetrelik bir kesi yapın. Kesi içine kapalı bir makas yerleştirin ve peritondan ayırmak için makası cildin altında açın. Bacaktaki cildi uyluk çevresinde kesin, daha sonra kasları ve kemikleri açığa çıkarmak için cildi bacaktan aşağı doğru kesin.
Arka bacağı kesmeden önce, makası doğru bir şekilde yönlendirmek ve kemik iliğinin çoğunun bulunduğu femurda kesikleri önlemek için kalça kemiğini palpe edin. Daha sonra femurdan kesmeden kalça ekleminin etrafını keserek arka bacakları çıkarın. Uzuvları uzuvlar etiketli bir tüpe yerleştirin.
Daha sonra, makas kullanarak kemiğe paralel keserek uzuvlardan biri boyunca kasları, dokuyu ve yağları çıkarın. Ardından, kemiğe dik bir kazıma hareketi yaparak kalan yağ veya kasları dikkatlice çıkarmak için bir neşter kullanın. Kemiği düzgün bir şekilde temizledikten sonra, femur ve tibia'yı dizde ayırın.
Daha sonra femur ve tibianın her iki ucunda görünür kemik iliğinin olmadığı yerlerde kesikler yapmak için bir neşter kullanın. Önceden hazırlanmış şırıngayı ve iğneyi kemiğe yerleştirin. Direnç varsa, daha fazla dirençle karşılaşmayana kadar kemiğin ucunu kesin.
Kemiği tüp etiketli kemik iliğinin üzerinde sıkıca tutun ve kemik iliği toplama solüsyonunu kemiğe enjekte edin. Sonra kemik iliğini tüpe kızartın. Kemik tamamen beyaz veya boş görünene kadar kemik iliğinin geri kalanını toplamak için kemiğin diğer ucu için tekrarlayın.
Boş bir 10 mililitrelik şırınga ve 20G iğne kullanarak, kemik iliğini şırıngada beş ila 10 kez yukarı ve aşağı çekerek tüpteki kemik iliği kümelerini kırın. Temiz bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne 40 mikronluk bir filtre ekleyin ve bir mililitre kemik iliği hasat çözeltisi ile durulayın. Kalan kümeleri çıkarmak için kemik iliğini filtreden geçirin.
Ardından tüp filtrelenmiş kemik iliğini etiketleyin. Filtrelenmiş kemik iliğini aynı gün kullanana kadar buzdolabında veya buzda saklayın. Kemik iliği hücrelerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170G'de santrifüj edin.
Supernatan'ı vakumlayın ve atın. Hücreleri 10 mililitre bir x kırmızı kan hücresi lizis tamponunda tekrar askıya alın ve dört dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra lizis tamponunun reaksiyonunu durdurmak için 30 mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini ekleyin.
Hücreleri oda sıcaklığında 170G'de sekiz dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve 10 ila 20 mililitre boyama tamponunda tekrar askıya alın. İlk olarak, hücreleri, kompanzasyon kontrolleri de dahil olmak üzere kullanılan boyama paneline bağlı olarak ayrı ayrı etiketlenmiş tüplere bölün.
Spesifik olmayan boyamayı engellemek için lekesiz kontroller ve izotop kontrolleri hazırlayın. Her flora dördü için, tek leke kontrolü ekleyin ve ayrıca kalan flora dörtlüsü ile birlikte floresan eksi bir kontrol ekleyin. Daha sonra, önerilen seyreltmeye göre antikorlar ekleyin ve tüplerin dibini hafifçe vurarak iyice karıştırın.
Tercihen, düşük hücre popülasyonlarını görselleştirmek için Fikoeritrin ile konjuge edilmiş EpCAM kullanın. Karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri BSL iki davlumbazına getirin ve her tüpe bir mililitre boyama tamponu ekleyin.
Daha sonra tüpleri 170G'de dört santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, kapaklı tüpleri BSL iki davlumbazına getirin ve süpernatanı aspire edin. Hücre peletini bir mililitre boyama tamponunda tekrar askıya alın ve karıştırmak için tüplerin tabanını hafifçe kaydırın.
Yıkama ve santrifüjlemeyi iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, akış sitometrisinden önce damağı 500 mikrolitre boyama tamponunda tekrar askıya alın. Üreticinin önerilerine göre DAPI veya ölü hücre ayırıcı ekleyin.
Bu protokolü kullanarak, nadir epitel hücresi popülasyonları farelerin kemik iliğinde görselleştirildi. Murin kemik iliğindeki hücrelerin% dört ila% 5'i, sayılan hücre sayısından bağımsız olarak EpCAM pozitifti. İnsan kemik iliği örneklerinde hücrelerin% iki ila% 5'i EpCAM pozitifti.
Ayrıca, her bir donör içindeki hücrelerin yüzdesi, kademeli olarak daha fazla hücre sayıldığı için tutarlıydı. Murin kan örneklerinde, hücrelerin% 0.5'inden azı EpCAM pozitifti. İnsan kan örneklerinde ise bu sayı hücrelerin yaklaşık% 0.3'ü idi.
Kontrol örnekleri çok az sayıda yanlış pozitif EpCAM pozitif hücre gösterdi. Ayrıca, EpCAM pozitif grupta sıralanan hücreler pan sitokeratin için boyama gösterdi. EpCAM negatif grubundan olanlar sitokeratin sinyalini göstermedi.
Temiz ve steril bir ortam sağlamak en önemlisidir. Bu, numunede herhangi bir kontaminasyonu önleyecektir. İzole epitel hücrelerinde işlevlerini belirlemek için kullanılabilecek birkaç aşağı akış uygulaması vardır.
Bunlar arasında RNA dizilimi, hücre kültürü in vivo deneyleri ve immünofloresan mikroskopisi bulunur.
