Эта модель может быть использована не только для изучения патогенеза АКД, но и применима для доклинической эволюции новых терапевтических методов, что имеет важное значение. Это стабильная и эффективная модель животных со многими преимуществами, такими как короткий экспериментальный период, простота в эксплуатации, очевидные симптомы и высокий уровень успеха. Наш экспериментальный протокол очень подробный и простой в эксплуатации.
Убедитесь, что вы правильно следуете каждому шагу протокола. Перед началом моделирования акклиматизируйте мышей к окружающей среде в течение одной недели со свободным доступом к пище и воде. В день лепки, используя ультрафиолетовую лампу и 75% спирт, очистите и продезинфицируйте окружающую среду и столешницы.
Нанесите мыльный раствор на живот мышей с помощью ватного тампона, а область по направлению роста волос сбрите лезвием или бритвой. Взвесьте мышь и сравните изменения веса в каждой группе. Перед выполнением стимуляции сенсибилизации брюшной полости убедитесь в полном восстановлении после любых незначительных повреждений кожи живота мыши, вызванных бритьем.
Приготовьте 0,5%-ный раствор ДНФБ и разбавьте его смесью ацетона и оливкового масла в соотношении 4 к 1. С помощью пипетки продуйте и перемешайте 20 раз, чтобы тщательно перемешать раствор DNFB. Нанесите 25 микролитров 0,5% раствора DNFB на середину области бритья живота с помощью пипетки и слегка распределите гладкой стороной наконечника пипетки, чтобы равномерно распределить его.
После 30 секунд стимуляции DNFB поместите мышь в пустую клетку без подстилки, чтобы мышь не вытирала раствор DNFB. Когда раствор полностью высохнет, верните мышь в прежнюю клетку со свободным доступом к пище и воде. Для стимуляции сенсибилизации уха сориентируйте тело мыши и сделайте внешнюю границу ушной раковины обращенной вниз, чтобы предотвратить попадание раствора в слуховой проход во время стимуляции DNFB.
На 4-й и 10-й день с помощью пипетки медленно и равномерно нанесите 20 микролитров носителя или 0,2% раствора DNFB на внутреннюю поверхность левой ушной раковины и аккуратно распределите раствор гладкой стороной пипетки. Оставьте правое ухо без лечения. Подождите, пока раствор DNFB высохнет, и поместите мышь обратно в клетку.
После стимуляции сенсибилизации брюшной полости и ушей взвешивайте мышей каждые два дня, начиная с первого дня. Сравните вес каждой мыши с нулевым днем и оцените влияние ACD на массу тела мышей по мере изменения веса. Делайте фотографии ушей мыши с высоким разрешением, чтобы записывать клинические симптомы ACD каждые два дня, начиная с первого дня.
Используя штангенциркуль, измеряйте толщину ушной раковины в одно и то же время каждый день для получения точных результатов. Остановите штангенциркуль от продолжения внутреннего зажима при небольшой закупорке, чтобы предотвратить повреждение тканей уха мыши. Сохраняйте фиксированное положение и записывайте данные для обоих ушей.
Запишите среднее значение трех данных и оцените отек уха в микрометрах. Чтобы оценить степень воспалительного отека на 11 день, приготовьте 0,5%-ный раствор красителя Evans Blue и разбавьте его PBS. Чтобы обездвижить мышь с помощью фиксатора, откройте крышку, зажмите хвост мыши, сделайте голову мыши лицом к фиксатору и позвольте мыши инстинктивно забраться в фиксатор.
Накройте крышкой. Сделайте так, чтобы хвост мыши вышел из отверстия на крышке и отрегулируйте длину фиксатора, чтобы обнажить весь хвост мыши. Несколько раз протрите хвост спиртовым ватным тампоном или замочите его в теплой воде на 30 секунд и аккуратно защипните корень хвоста, чтобы наполнить, и расширьте жилки с обеих сторон.
Медленно вводите раствор красителя Evans Blue в вену хвоста мыши с помощью инсулиновой иглы диаметром 1 мм под облучением источника холодного света. Подождите 15 минут, чтобы сфотографировать уши мыши. Уши мыши в группе DNFB демонстрировали очевидные клинические симптомы, сравнимые с ACD, с чувствительными участками, демонстрирующими типичные симптомы покраснения, сухости, эрозии и экссудации.
Тем не менее, введение чистой воды или растворителя в ухо не вызывало каких-либо симптомов, подобных группе DNFB. В группе DNFB, по сравнению с необработанным правым ухом, толщина левого уха значительно увеличилась после стимуляции DNFB. Существенной разницы в контрольной и автомобильной группах не выявлено.
Левое ухо мышей группы DNFB стало темно-синим после инъекции красителя Evans Blue, который визуально отличался от правого уха. Левое и правое ухо мышей в контрольной группе и группе транспортных средств были примерно одинакового цвета. Увеличение веса мыши было немного замедлено DNFB или простой стимуляцией транспортного средства, но не привело к значительной потере веса.
Повторная стимуляция DNFB в ухе мыши приводила к увеличению селезенки и увеличению индекса селезенки. Напротив, индекс селезенки мышей в группе транспортных средств существенно не изменился. Убедитесь, что раствор DINFB полностью перемешан и равномерно нанесен на ухо мыши, не попадая в слуховой проход.
Это залог успеха моделирования.
