Оптический пинцет позволяет физически захватывать и манипулировать объектами микронного и нанометрового масштаба неинвазивно, используя только сфокусированный лазерный луч. Этот инструмент в настоящее время успешно применяется к различным биологическим структурам, в том числе и к расщепляющим клеткам. Наша лаборатория нацелена на исследование прямого межклеточного взаимодействия на уровне отдельных клеток и дальнейшее лечение этого латерального расположения и структурирования с помощью многообещающих методов, таких как оптический пинцет.
Во-первых, текущей экспериментальной проблемой является отсутствие протокола для создания гибридных сфероидов с использованием оптического пинцета для всего процесса. Во-вторых, стабилизация по новой реформе гибридных сфероидов и извлечение их для последующей экспериментальной обработки. В этом протоколе мы пошагово демонстрируем построение сфероида гибридной лимфомы с использованием оптического пинцета.
Основным преимуществом данной методики является возможность изучения прямых взаимодействий между клетками лимфомы и трехмерным микроокружением в режиме реального времени, что является более биологически значимым, чем традиционная клеточная культура. Важно отметить, что представленная здесь методика может быть легко адаптирована к клеточным линиям лейкемии и другим гематопатологическим злокачественным новообразованиям. Мы планируем использовать наши методы для изучения мельчайших изменений адгезии одиночных клеток, индуцированных противораковыми препаратами.
Для этой цели мы намерены использовать опухолевую линию пациента. Начните с подготовки микроформы. Промойте 3D-чашку Петри с микроформами в деионизированной воде и поместите ее под ультрафиолетовую баранину на 30 минут для проведения стерилизации.
Сначала приготовьте 2%-ный раствор агарозы, растворив порошок агарозы в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с помощью микроволновой печи. Избегайте образования пузырьков при смешивании или пипетировании агарозы. Остудите агарозу примерно до 70 градусов по Цельсию.
Далее приготовьте гидрогели, заполнив предварительно стерилизованные микроформочки 500 микролитрами агарозы. Удалите все пузырьки, которые могут быть застрявшими в мелких деталях микроплесени, с помощью пипетирования. Через 15 минут, когда агароза застынет, аккуратно выньте гели из микроформ на стерильную шестилуночную пластину.
Прежде чем перейти к следующему шагу, проверьте под микроскопом, убедитесь, что гель был приготовлен правильно. Добавьте фосфатный буферный солевой раствор, полностью покрывающий микроформы, перед помещением тарелки под ультрафиолетовую лампу на 30 минут для проведения стерилизации. Перед использованием устройств на основе агарозы для получения сфероидов уравновесьте гель, полностью покрыв их средой RPMI, и инкубируйте в течение минимум 15 минут.
Культивируют мезенхимальные стромальные клетки HS-5 в полной культуральной среде RPMI в стандартных условиях, обеспечивая смену среды каждые 48 часов. Когда клетки достигнут 90% конфлюенции, удалите питательную среду. Промойте клетки фосфатным буферным раствором и отделите их от дна культуральной колбы с помощью трипсина.
Прекратите прием трипсина, добавив два миллилитра питательных сред, после чего переложите их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте ячейки при 300-кратном давлении в течение семи минут. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре свежей питательной среды.
Подсчитайте ячейки в автоматическом счетчике с помощью tryp и синего раствора. Разбавляют их до 200, 000 клеток на миллилитр. Удалите питательную среду из приборов на основе агарозы.
Осторожно засейте 190 микролитров клеточной суспензии в камеру посева клеток агарозной микроплесени. Инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, пока клетки не осядут на дне геля. Медленно добавьте четыре миллилитра дополнительной среды наружу гелей, покрывая их целиком.
Помните, что средство следует добавлять не непосредственно на гель, а в чашку для культивирования, чтобы не повредить свежеобразовавшиеся сфероиды. Инкубировать в течение 72 часов при температуре 37 градусов Цельсия до образования равномерных сфероидов. Гематологическая клеточная линия выращивается свободно плавающей в питательных средах в колбах, предназначенных для суспензионного культивирования.
Для поддержания оптимальных свойств клеток рекомендуется начинать подготовку образца не ранее, чем за 30 минут до начала процедуры кислотного биллирования распределяемых сфероидов с помощью оптического пинцета. Хранить клетки в среде RPMI 1640 в стандартных условиях культивирования. Поддерживайте культуру в диапазоне от 300 до 500 000 клеток на миллилитр, проходя каждые два-три дня.
Для манипуляций в оптическом пинцете выбирайте ячейки в логарифмической фазе. Соберите клетки и переложите всю суспензию в 15 миллилитровую трубку. Центрифугируйте ячейки при 300-кратной гравитации в течение семи минут.
Удалите надосадочную жидкость и подсчитайте клетки, как описано ранее. Разбавьте суспензию до достижения конечной плотности клеток 10 000 клеток на миллилитр. Держите клетки при температуре 37 градусов Цельсия до оптической манипуляции.
Протокол, который мы представляем здесь, был разработан специально для изготовленного на заказ оптического пинцета. Тем не менее, коммерческие системы становятся все более доступными. Независимо от того, какой тип оборудования имеется в вашей лаборатории, основные этапы подготовки системы и общие принципы работы с клетками остаются неизменными.
Включите источник света микроскопа. Носите безопасные для лазера защитные очки. Включите лазер и установите мощность на 100 мегаватт.
Прежде чем продолжить, подождите 10 минут, дав лазерному лучу стабилизироваться. Тем временем запустите компьютерное программное обеспечение. Как только система будет готова, добавьте 30 микролитров воды в центр нижней цели.
Поставьте на предметный столик 35-миллиметровую чашку для микроскопии со стеклянным дном. Стабилизируйте блюдо с помощью держателей. Поднимите объектив с помощью винта микроскопа до тех пор, пока капля воды не коснется стеклянного дна чашки для микроскопии.
С помощью микрометрического винта аккуратно отрегулируйте столик до тех пор, пока на экране не появится резко сфокусированный лазерный луч. В окне программного обеспечения вы увидите изображение образца с микроскопа. С помощью видимых на экране маркеров переместите оптическую ловушку в нужное место.
Добавьте 100 микролитров заранее приготовленной суспензии клеток лимфомы. Дайте им опуститься на дно блюда. На это уйдет примерно пять минут.
С помощью движений предметного столика микроскопа найти плавающую клетку лимфомы. Позвольте оптической ловушке поразить образец, щелкнув по ловушке с проклятием. Постарайтесь переместить ячейку в нужное место.
Чтобы клетка была пригодна для манипуляций, она должна быть способна легко перемещаться в любом заданном направлении. Извлеките один стромальный сфероид из агарозной формы с помощью наконечника пипетки и поместите его на стеклянную посуду без покрытия. Добавьте два миллилитра питательной среды и выдерживайте 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
За это время сфероид будет мягко прилипать к стеклу, что препятствует движению во время манипуляции. Поместите чашку со сфероидом на предметный столик микроскопа. Добавьте 1000 клеток лимфомы в 100 микролитров питательной среды.
Дайте им опуститься на дно блюда, что займет примерно пять минут. Выберите одну клетку лимфомы и захватите ее с помощью лазерного луча. Переместите оптическую ловушку, чтобы доставить клетку в контакт с поверхностью стромального сфероида.
Начните с прикрепления клетки лимфомы к сфероиду стромы на 10 секунд. Затем проверьте, прикреплена ли клетка навсегда, с помощью трех повторных попыток отсоединения клетки лимфомы с помощью оптического пинцета. Если клеточный контакт нарушен, прикрепите клетку лимфомы к поверхности сфероида еще раз с помощью оптической ловушки, на этот раз на более длительный период времени, примерно на 20 секунд.
Повторяйте этот процесс с последующими клетками лимфомы до тех пор, пока вся поверхность стромального сфероида не будет покрыта клетками лимфомы. Изменяя плоскость изображения с помощью винта микрометрического микроскопа, можно изменить положение оптической ловушки, что позволяет более глубоко перемещать захваченные объекты внутрь образца. Для лучшего представления спонтанно сформированного сфероида покройте ядро стромальных клеток двумя-тремя слоями клеток лимфомы.
Аккуратно удалите питательную среду и непосредственно промойте сфероид 100 микролитрами фосфатного буферного раствора. Инкубируйте гибридные сфероиды со 100 микролитрами PBS, содержащими один микромоль иона кальция и два микромоля гомодимера-1 этидия, в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. С помощью флуоресцентной микроскопии наблюдайте за сфероидами и получайте изображения.
Здесь мы успешно реконструировали гибридный сфероид человека, состоящий из мезенхимальных стромальных клеток и клеток лимфомы, с помощью оптического пинцета. Во-первых, сфероиды мезенхимальных стромальных клеток были получены в устройстве с агарозной микролункой, что приводит к получению относительно однородных сфероидов после 72 часов инкубации. Жизнеспособность сфероидов была выше 98%Далее мезенхимальные сфероиды были использованы в качестве ядра сфероида вновь сконструированных гибридов с использованием оптического пинцета.
Клетки лимфомы были индивидуально захвачены оптическими ловушками и прикреплены к поверхности стромального сфероида. Процедуру повторяли до тех пор, пока вся поверхность стромального сфероида не покрывалась клетками лимфомы. Установлено, что клетки RI-1 прикрепляются к стромальному сфероиду за 11,67 секунды с отклонением 3,73 секунды.
В ходе этого процесса было прикреплено 65 ячеек, что заняло примерно один час и 12 минут. Окрашивание вновь сконструированных сфероидов показало высокую жизнеспособность клеток, используемых для манипуляций, на уровне 93%В этой статье предлагается неинвазивный протокол формирования сфероидов стромальных клеток лимфомы с использованием оптического пинцета. Этот метод не только конструирует гибридные сфероиды de novo, но и позволяет точно контролировать количество прикрепленных клеток и время формирования адгезии, предоставляя ценную информацию для тканевой инженерии.
Кроме того, этот подход с помощью оптического пинцета облегчает изучение ранней стадии образования сфероидов с высоким риском, что не может быть достигнуто с помощью стандартных объемных методов. Самое главное, что наш протокол может быть легко применен к другим типам клеток, что позволит этому подходу на основе оптического пинцета все чаще использоваться в области 3D-клеточных культур.
