생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

요약

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

초록

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

서문

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping¹. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis². When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm², the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment^3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells⁵, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor⁶, and contact inhibition^2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited^8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)^10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion¹⁴. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation^15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

프로토콜

모든 절차는 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 문에 연구를위한 협회 부여 본 연구에서 다음과 국립 대만 대학 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 격리, 차 문화의 제조 및 소 CECs의 면역 염색

1. 로컬 도살장에서 신선한 소 눈을 획득.
2. 3 분 동안 10 %의 v / w 포비돈 요오드 용액에 눈 소독. 인산염 완충 식염수 (PBS) 솔루션을 씻으십시오.
3. 무균 조건에서 메스와 가위로 각막 버튼을 수확. 해부 현미경 집게로 껍질 데스 메막 (이 연구에서 그주의, 소 눈은 로컬 도살장에 의해 적출 된, 따라서 첫 번째 연구 절차는 실험실에서 preenucleated 눈의 소독이었다).
4. 시도 1 ㎖에 데스 메 막을 품어30 분 동안 37 ° C에서 psin. 5 분 112 XG에서 원심 분리하여 소 CECs를 수집합니다. 보충 호르몬 상피 매체 (SHEM) HEPES 완충 둘 베코 변형 이글 배지와 5 % 소 태아 혈청이 보충 된 햄 F12 배지, 0.5 % 디메틸 술폭 시드, 인간 표피 2 ng를 / ㎖의 동일한 양을 함유하는 1 ml의 세포를 재현 탁 성장 인자, 5 밀리그램 / 인슐린 ㎖, 5 밀리그램 / 트랜스페린 ㎖, 5 NG / 셀레늄 ㎖, 콜레라 독소의 1 nmol의 / l, 50 밀리그램 / 젠타 마이신 ㎖, 1.25 밀리그램 / 암포 테리 신 B의 용액
5. 6 형상 접시에 세포 (안구 당 ​​약 1 × ¹⁰⁵ 세포)를 시드. 셈 문화를. 공기 중 5 % CO ₂ 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션 접시. 3 일마다 배지를 변경합니다.
6. 세포가 합류점에 도달하면, PBS로 씻어, 5 분 동안 37 ° C에서 트립신 1 ㎖ 그들을 부화. 5 분 112 XG에서 원심 분리를 수집합니다. 셈 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
   1. 혈구의 세포를 계산합니다. A A 24 웰 플레이트에 웰 당 1 × ^104의 밀도, 문화 셈의 셀에서 커버 슬라이드에 세포를 시드. 타틴의 EnMT 억제 효과를 조사하는 경우, 타틴의 μM이 배양 배지에 첨가 10 SHEM에서 세포를 배양하고, 3 일마다 배양액을 변경합니다.
7. 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 250 ㎕를, pH가 7.4으로 지시 된 시점에서 세포를 고정한다. 5 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 250 ㎕를 함께 Permeabilize 하시려면. 30 분 동안 10 %의 소 혈청 알부민으로 차단.
8. 밤새 4 ℃에서 활성 베타 - 카테닌 (ABC), 달팽이와 민달팽이에 대한 일차 항체와 세포를 품어. 200 : 사용 된 일차 항체의 희석은 1입니다. 항체는 10 mM의 PBS, 1 %의 v / w 소 혈청 알부민 및 0.09 % w / V의 아 지드 화 나트륨으로 구성된 항체 희석제로 희석된다.
9. 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 세척하고, 품어1 시간 동안 실온에서 (항체 희석액 100 1) 알렉사 형석 접합 이차 항체 m.
10. 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 2 μg의 / ml의 세포를 피복하여 세포 핵 Counterstain과 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 씻어 장착 용액을 안티 페이드로 마운트.
11. 20X 목적 배율 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 405 및 488 nm의의 여기 파장에서 면역 형광 이미지를 얻습니다.

2. 쥐 각막 내피 Cryoinjury 모델 및 내원시 주입

1. 2 % 자일 라진 (5.6 ㎎ / ㎏) 및 tiletamine 플러스 zolazepam (/ kg 18 mg)을 근육 주사이 12 주령의 수컷 흰쥐를 마취. 가볍게 피부 경련의 부재하에 적절한 마취를 확인하기 위하여 동물의 피부를 끼우는.
2. 눈의 통증과 깜짝 반사를 최소화하기 위해 각 쥐의 오른쪽 눈에 0.5 % proparacaine 염산염 한 방울을 주입. 주입왼쪽 눈에 테트라 사이클린 연고는 각막 건조를 방지합니다.
3. 액체 질소 스테인레스 스틸 프로브 (직경 = 3 mm)를 냉각. 30 초간 오른쪽 눈의 중심 각막 스테인리스 프로브를 적용한다. 자주 각막 건조를 방지하는 절차 중 우측 눈에 PBS를 주입.
4. 즉시 cryoinjury 후 0.1 % 아트로핀 및 0.3 % 황산 젠타 마이신을 주입 매일 한번 섬모 경련으로 인한 안구 통증을 완화하고, 감염을 방지 할 수있다.
   1. 시술 후, 래트를 가열 램프를 이용하여 보온, 그들은 모터 제어를 회복 할 때까지 마취 회복 후에도 15 분마다 관찰. 또한 회복 기간 동안 각막의 건조를 방지하기 위해 우안에 테트라 사이클린 연고를 적용한다.
5. 3 일 연속 각막 cryoinjury를 반복합니다.
6. 전술 한 바와 같이 쥐 눈의 전방 챔버로 타틴 또는 bFGF를 전달 들어, 래트를 마취. 한 방울을 주입오른쪽 눈에 0.5 % proparacaine 염산염의 눈의 통증과 깜짝 반사를 최소화합니다.
7. 멸균 PBS와 안구 표면을 관개. 홍채에 위의 평행 한 평면에 paralimbal 맑은 각막에 1 ML의 주사기에 부착 된 30 G 바늘을 삽입하여 운영 현미경으로 전방 천자를 수행합니다.
8. 바늘이 최대 베벨 켜고, 약간 약간의 방수를 배출하고 안압을 줄이기 위해 각막 상처를 우울. 에 각막 약 0.02 mL의 주입. 조심스럽게 바늘을 철수하는 동안면 끝이 바늘 관을 압축합니다.
9. 운영 현미경 지시 된 시점에서, 외부 눈 사진.

3. 수확 쥐 각막 버튼과 면역 염색

1. 래트를 안락사하려면 안락사 챔버에 배치 분당 챔버 부피 10-30 %의 충전 속도로 100 % CO _{2 달이다.} 에 대한 CO ₂ 주입 유지호흡의 부족 및 머 금고 눈 색깔 후 추가 분.
2. 날카로운 블레이드와 윤부에서 쥐의 눈을 침투. 윤부를 따라 각막 가위로 각막을 잘라. 슬라이드에 각막을 평평하게. 각막이 꼬고 경우 추가 반경 방향 절개를합니다.
3. 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 250 ㎕를, pH가 7.4으로 각막을 수정. 5 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 250 ㎕를 Permeabilize 하시려면로, 30 분 동안 10 %의 소 혈청 알부민으로 차단.
4. (1)의 희석 4 ° C에서 하룻밤 ABC에 대한 일차 항체로 각막을 품어 : (200) 항체 희석액에. 15 분 동안 PBS로 두 번 씻어 각막 및 이차 항체로 배양 한 1 시간 동안 실온에서 (1 항체 희석제 100). 셀 2 μg의 4 / ㎖ ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌로 세포를 피복함으로써 핵 및 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 씻어 Counterstain과.
5. 설치 솔루션을 방지 페이딩의 각막을 탑재합니다. 산부인과20X 대물 확대 한 레이저 스캐닝 공 초점 현미경으로 면역 (405)의 여기 파장 및 561 nm의 이미지를 주석 박.

결과

소 CECs의 분리 후, 세포를 시험관 내에서 배양 하였다. (1)가 소 CECs의 위상차 이미지를 보여주고있다. 합류 셀의 육각형은 세포가 세포 분리 동안 각막의 간질 섬유 아세포에 의해 오염되지 않은 것으로 나타났다. (2)는 지정된 시점에서 ABC, 달팽이와 민달팽이에 대한 항체를 이용하여 수행 한 면역 염색을 보여주고있다.

토론

CECs는 세포 증식 동안 EnMT를 받아야하는 그들의 성향 알려져있다. 치료 목적 EnMT 처리를 억제하기위한 전략을 개발하려면 EnMT기구의 완전한 이해가 필요하다. 우리는 EnMT, 체외 배양 모델 쥐의 각막 내피 세포의 cryoinjury 모델, 즉 소 CEC를 조사하기 위해이 모델을 설명했다. 우리의 결과는 두 모델의 EnMT 과정을 보여 주었다. 또한, 타틴의 EnMT 억제 효과는이 두 모델은 동일한 메커니즘을...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug