מדידת דוגמנות התכווצות ייבוש אנושי שכבה קרנית

Summary

מאמר זה מתאר שיטה לכימות התנהגות הייבוש הדינמית תכונות מכאניות של שכבה קרנית על ידי מדידה נפתרה מרחבית ב-מטוס התקות ייבוש של דגימות רקמה עגולות דבקות מצע אלסטומר. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למדוד עד כמה שונה טיפולים כימיים לשנות תכונות מכאניות ייבוש ורקמות.

Abstract

השכבה הקרנית (SC) היא שכבת העור השטחית ביותר. הקשר שלה עם הסביבה החיצונית כלומר שכבת רקמה זו נתונה הוא סוכני טיהור וריאציות יומיות ב לחות סביבה; שניהם יכולים לשנות את תכולת המים של הרקמה. צמצום ההוצאה לנפש תכולת המים מליקוי בתפקוד מחסום חמור או בסביבות לחות נמוכה יכול לשנות נוקשות SC ולגרום הצטברות של לחצים ייבוש. בתנאים קיצוניים, הגורמים הללו עלולים לגרום לקרע מכאני של הרקמה. הקמנו שיטת תפוקה גבוהה של לכימותי שינויים דינמיים התכונות המכאניות של SC על ייבוש. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת על מנת לכמת שינויים בהתנהגות ייבוש תכונות מכאניות של SC עם טיפולי פנים וקרם לחות קוסמטיים. זו מושגת על ידי מדידת וריאציות דינמיות התקות ייבוש ב-מטוס נפתרו מרחבית של דגימות רקמה עגולות דבקות מצע אלסטומר. ב-מטוס ACQ התקות רדיאליuired במהלך הייבוש הם ממוצעים azimuthally ומצוידים פרופיל המבוסס על מודל contractility ליניארי אלסטי. שינויים דינמיים מתח ייבוש SC מודולוס אלסטיות אז יכולים להיות מופקים פרופילי המודל המצוידים.

Introduction

השכבה החיצונית ביותר של האפידרמיס, או השכבה הקרנית (SC) מכילה תאי corneocyte מלוכדים מוקף מטריצת שומנים עשירה ^{1, 2.} שלמות הרכב והמבני של SC חיונית לשמירה פונקציונלית מחסום נכון ^3, המונע פלישה מפני מיקרואורגניזמים מתנגד הוא כוחות מכאניים ואובדן מים מופרז ^4. הקיבולת של מוצרי טיפוח אישיים לשמור או לבזות פונקצית עור מכשול עניין רב בריאות עור בתעשיית הקוסמטיקה ^5. היישום היומי של מוצרי טיפוח אישיים ידוע לשנות את התכונות המכאניות של SC ^{6, 7, 8.} לדוגמא, פעילים שטח כלול ניקוי קוסמטי יכול לגרום עליות משמעותיות מודולוס האלסטיות וכן הצטברות שלמדגיש ייבוש ב SC, הגדלת הנטייה של הרקמות לפצח ^{7, 9.} גליצרול הכלול כמעט כל לחות קוסמטית יכול לרכך SC ולהפחית את ההצטברות של לחצי ייבוש ^{8, 10, 11,} הקטנת הסיכוי לקרע ברקמות.

השיטה המפורטת במאמר זה הוא מסוגל לכימות התנהגות ייבוש דינמי תכונות מכניות של ייבוש SC בסביבה מבוקרת ^{7, 8.} בעבר, בטכניקה זו הודגמה להיות מסוגל להבהיר את ההשפעה של מוצרי קוסמטיקה שונים על שינויים בהתנהגות ייבוש דינמי תכונות מכניות של רקמות SC. זו מושגת על ידי לכימותי הצטמקות נגרם ייבוש של רקמות SC אדם דבקות מצע אלסטומר רך, מתאימות התקות ייבוש עם פשוטמודל התכווצות, ולאחר מכן חילוץ מודולוס האלסטיות וייבוש מתח מהפרופיל המצויד. כאשר בדיקות של דגימות SC מרובות נדרשו, שיטה זו מציעה אלטרנטיבה מהירה יותר tensometry uniaxial, מנצלת רקמות פחות משמעותי ומספקת יותר פיסיולוגי ייבוש רלוונטי ידי מניעת אידוי מן החלק התחתון המדגם.

Protocol

אישור פטור (3002-13) לבצע מחקר באמצעות זיהו דה דגימות רקמה על פי מחלקת הבריאות ושירותי האנוש תקנות, 45 CFR 46.101 (ב) (4) ניתנה. עור בעובי מלא מתקבל מניתוח אלקטיבי. במאמר זה, מקור רקמת שד נקבה לבן 66 בן.

1. הכנת Coverslips מצופה אלסטומר

1. בקבוקון זכוכית 20 מ"ל, לערבב 0.107 גרם של סוכן Sylgard 184 ריפוי עם בסיס 5.893 גרם. מסת התערובת הכוללת היא 6 גרם עם בסיס לריפוי יחס סוכן של 55: 1.
2. לאחר ערבוב עם מוט זכוכית כדי להבטיח אחידות, למקם את בקבוקון זכוכית בתא ואקום דגה כדי להסיר את כל הבועות.
3. מניחים כיסוי החלקה זכוכית (55 מ"מ x 25 מ"מ) במרכז של coater ספין. הוסף את ~ 1 מ"ל של מהעיסה למרכז של החלקה מכסה. השתמש פיפטה 5000 μL עם סוף לנתק במספריים. ספין המעיל-להחליק את המכסה ב 2000 סל"ד במשך 60 שניות.
   1. חזור p זהrocess ליצור 5-6 מצעים.
4. לרפא את התלושים לכסות בתנור במשך 12 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.
5. השתמש סכין גילוח כדי להסיר את סרט אלסטומר חלקי של מצע הקרבה. השתמש סמן בל יימחה לציון למעלה של סרט אלסטומר ואת הזכוכית החשופה.
6. הר המדגם על מיקרוסקופ הפוכה ולהשתמש אביזר פוקוס מרחוק להקליט את ההבדל בגובה z בין המטוסים המוקד של שני הסימנים. זו תואמת את עובי מצע אלסטומר, h.

2. הכנת השכבה הקרנית

1. השתמש באמבט מים או צלחת ומערבבים מחוממת לחום כוס זכוכית המלאה למחצה במים ללא יונים (DW) עד 60 ° C. בתוך ארון בטיחות ביולוגית, לטבול את העור האנושי בעובי מלא במים למשך 4 דקות.
2. מיד להעביר את המדגם העור לתוך מבחנה המכילה DW מקורר <10 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. חצי ממלא את הכוס ממזערת מתיז חומר ביולוגי מסוכן.
3. הסר את העור מן הקנקן, ומניחים בצלחת פטרי, ובעדינות לבודד את האפידרמיס באמצעות פינצטה רקמות כפוף חוטם.
4. מניחים את האפידרמיס מבודדת בצד הבסיס למטה בצלחת פטרי מרופדת גזה. ודא שכבת הבסיס היא מלא במגע עם הגזה.
   1. משרים את גזה בתמיסה טריפסין 0.25% (wt / כרך) הקלד IX-S הלבלב חזירי מומס 0.1 מלוחים M פוספט שנאגרו במשך 6-8 שעות בטמפרטורת החדר. הוסף רק מספיק טריפסין במיכל להרטיב גזה.
5. הרם את הגזה עם פינצטה רקמות לצוף אותו במכל מלא חלקית עם DW. משוך בעדינות את SC להפרידו גזה.
6. שטוף את השכבה הקרנית 3-4 פעמים DW להסרת רקמת אפידרמיס שיורית כי נשאר מחובר SC.
7. Float ערך SC המבודד בתמיסה של מקסימום גליצין 0.4% (סויה) מעכב טריפסין ב DW. השתמש צלחת שייקר כדי להתסיס את הרקמה למשך 10 דקות.
8. Float SC בצלחת פטרי חלקיתמלא DW. השתמש צלחת שייקר כדי להתסיס את הרקמה למשך 10 דקות.
9. יבש את גיליון SC מבודד על רשת פלסטיק אולטרה בסדר במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס, 40% לחות יחסית (RH)).
10. הפרד את SC מן הרשת לגזור דגימות R עגול פרט = 3 מ"מ רדיוס באמצעות אגרוף חור עגול. מארק במרכז הפנים קצוני עם סימן ספירלה קטנה באמצעות סמן בל יימחה. זה מספק רמז חזותי להכרה בצד העליון של SC.
    הערה: חותם בל יימחה צריך להיות מיושם במרכז המדגם, שבו דפורמציות הייבוש תהיינה קטנות ביותר. זה יהיה למזער את ההשפעה של הסמן על פרופילי עקירת ייבוש מוקלטים.

לדוגמא 3. טיפול הפקדה

1. להתסיס דגימות SC למשך 30 דקות ב 15 מ"ל DW המכיל חרוזי ניאון 90 μL סמן (505/515 ננומטר, 1 מיקרומטר קוטר, carboxylate-שונה). פיקדונות זה חרוז על גבי משטח SC
   הערה: בעוד בתצהיר של lמספרי arge של חרוזים על SC עשויים ביחס ייבוש איטי באופן שולי דגימות ללא חרוזים נוכחי ^12, זה יהיה למקסם את הרזולוציה המרחבית של שדות דפורמציה ב-מטוס שניתן להשיג מאוחר יותר. הבחירה של נפח חרוז הוסיפה ולכן צריך להיעשות אד הוק.
2. הסר דגימות SC ומניחים אותם בצלחת פטרי מלא חלקית עם DW.
3. חלקית לטבול מצע של DW בזווית שטוחה של 15-30 מעלות.
4. הצמדת קצה מדגם SC צף עם קו המגע בין המצע לבין ממשק מים. אנכי משייכת המצע מהמים יהיה חלקה לרבד מדגם SC למצע ללא קמטים או בועות אוויר לכוד.
5. חזור על שלב 3.4 להציב עד 6 דגימות SC על כל מצע. השאר לפחות פער 2-3 מ"מ בין דגימות ולהימנע למינציה מדגם קרובה לקצה המצע. זה מונע התייבשות של התקות ייבוש אחד מדגם משפיעים אחר.
6. ייבש את דגימות SC רכובים בתנאי מעבדה במשך 60 דקות. זה מאפשר למים שיורית בין הכרטיס לבין המצע להתאדות ומבטיח הידבקות רקמות מלאה.
   הערה: בשלב זה, דגימות SC יכולה להיות מטופלים עם חומר כימי או בתכשירים קוסמטיים ^{7, 8} על ידי נחת המצעים הפוכים פתרון רצוי לתקופה נדרשת של זמן. חזור על שלב 3.6 לאחר צעד הטיפול מתבצע. לאחר ייבוש, הדבקה שלמה של דגימות SC למצע ניתן לאמת באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר. בועות לכודים תחת מדגם SC או קצות delaminated תהווינה וריאציות בניגוד ברורות במדגם עם קצוות מוגדרים היטב.
7. ליצור תא לחות על ידי הצבת צלחת פטרי מלאה חלקית עם מים לתוך מיכל אטום הרמטית.
8. מצעי מקום ההחדרה של 24 שעות כדי לאזן לחות יחסית של 99%. אל תניחו את המצעים לתוך Petrאני מנה.

4. איכות הסביבה מיקרוסקופ

1. להשיג שליטה על תנאים סביבתיים באמצעות מערכת בקרת לחות מחובר תא זלוף מיקרוסקופ לטעינה. פרטים אודות מערך בקרת לחות ניתנים בגרמנית et al. (2013) ⁷ וליו וגרמנית (2015) ^8.
2. הר המצע על המיקרוסקופ, למקם את תא זלוף מעל המצע ולאטום הקצוות של תא זלוף אל אלסטומר באמצעות גריז ואקום.
3. לאחר רכוב, לאזן אוויר פנימי ל -99% לחות יחסית לפני ניסויים. זה מונע אידוי של מים לפני ניסויים. לאחר הדמיה בסעיפים 5 או 7 החלה, להפחית לחות אוויר פנימי הערך הרצוי.
   הערה: במאמר זה, דגימות SC הן יבשות עד 25% לחות יחסית

5. הדמיה התקות ייבוש Plane

1. לרכוש תמונות של דגימות SC באמצעות microsco הפוכהPE עם עדשה אובייקטיבית 1X. Excite חרוזי ניאון באמצעות מנוע אור עם מסנן FITC (bandpass פליטת 503-530 ננומטר). ניתן הדמיה ברצף דגימות מרובות ברחבי ייבוש באמצעות במת XY אוטומטית.
2. ניאון להקליט תמונות אור המועבר באמצעות מצלמת CCD דיגיטלית ברזולוציה של 1,392 x 1,040 פיקסלים. שדה הראייה של כל תמונה הוא 8.98 x 6.71 מ"מ, המאפשר תמונה אחת כדי ללכוד מדגם SC מלא. צלמו תמונות עם תדר של 10 דקות במשך 16 שעות.

6. הכנת תשתית עבור מדידת עובי

1. במנדף כימי, מקום 1 silane מ"ל (3-aminopropyltriethoxysilane; ≥98%) בחלק מכסה פלסטיק קטן. מניח מצעים אלסטומר מסעיף 1 ואת הכובע במכל אטום במשך 5 שעות. אל תאפשר מצעים לבוא ישירות במגע עם silane.
2. הוסף 5 מ"ג של EDC (N - (3-Dimethylaminopropyl) - N hydrochloride -ethylcarbodiimide; ≥99%) בצינור 1.5 מ"ל. הוסף 500 μL של DW אל EDC. להתסיס הפתרון עבור 10 s עם מערבל מערבולת.
3. להוסיף tetraborate נתרן 0.076 גרם ו -0.1 גרם חומצת בור ל -20 מ"ל DW. מערבבים בעזרת בוחש מגנטי ב 70 מעלות צלזיוס (1 ח). הוספת חומצה בורית עד pH הוא 7.4.
4. הוסף 20 מ"ל של חיץ borate לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הוסף 60 μL של 1 מיקרומטר חרוזים (535/575 ננומטר, carboxylate-שונה) למאגר borate. לבסוף, להוסיף 200 μL של פתרון EDC לבקבוק. לנער את הצינור לערבב פתרון חרוז ואז לשפוך לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ.
5. הסר את מצעי silanated מהמכל ומניח אותם אלסטומר בצד סרט לתוך הפתרון החרוז. האם כל כך לאט כדי למנוע בועות מלהפוך לכודים. שני מצעים יתאימו בכל צלחת פטרי.
6. השאר מצעים לצוף הפתרון החרוז במשך 45 דקות.
7. להשתמש בפינצטה כדי להסיר את המצעים מהפתרון החרוז, ולאחר מכן לשטוף ב DW להסיר חרוזים מאוגדים.
8. האוויר יבש מצעים. משבי אוויר דחוס מעלפני השטח את סרט אלסטומר מפחית את ההיווצרות של כתמי מים.
9. חותם את מצעי תיבת אטום כדי למנוע צילום הלבנה של החרוזים עד בתצהיר מדגם SC.

7. עובי הדמיה של SC

1. דגימות אויר SC על מצע באמצעות סעיף 3. עם זאת, לבצע שלב 3.1 מבלי להוסיף חרוזים פלורסנט אל DW. בנוסף, להחיל ירידה של 5 μL של פתרון חרוז בסמן פלורסנטי חי (505/515 ננומטר, 0.1 מיקרומטר קוטר) אל פני השטח של כל דגימה SC שהופקדו עם טפטפת לפני השלמת שלב 3.6.
2. להקים מדידות של עובי SC באמצעות מיקרוסקופ עם עדשה אובייקטיבית 40X. מדוד את העובי של דגימות SC לאורך זמן באמצעות אבזר מוקד מרחוק להקליט את ההבדל בגובה z בין מטוסי מוקד שכבת השני החרוז ממוקמים בממשק SC-המצע לבין למעלה של SC.
3. מדוד את העובי של 3 אזורים של כל דגימת SC פני תקופת ייבוש 3 שעות. העובידגימות SC מגיע לערך למצב יציב בתוך מסגרת זמן זו ^8.

כימות 8. דפורמציה רקמות דוגמנות

1. השתמש velocimetry תמונת חלקיקים ¹³ להשיג ב-מטוס נפתרו מרחבית התקות ייבוש מתמונות הניאון בכל שלב היסטוריה מתועדת.
2. השתמש MATLAB להשיג בממוצע azimuthally רדיאלי ועקירת azimuthal פרופילים משדה העקירה של כל דגימת SC סימטרית רדיאלית.
   הערה: מערכת נתונים לדוגמה (תחת הכותרת "d.mat ') וקוד MATLAB (תחת הכותרת" PIV-processing.m') שמבצע הן שלב זה צעד 8.3 סופק במידע משלים.
3. התאם פרופילי עקירה רדיאלי למודל ^{7, 8, 14, 15, 16} מתאר SC ייבוש בתור circula ליניארי מתכווץ אלסטידיסק r זמן משתנים עובי, _SC h, רדיוס, R, מודולוס אלסטיות, _SC E, דבקה מצע ובר-עיוות אלסטי עם מודולוס אלסטיות, א נניח SC יש מוגדרת היטב וקבוע מקדם פואסון, ν _SC = 0.4 ^{7 , 8.} השג המתאימים ביותר באמצעות גישת ריבועים לפחות מינימום.
   הערה: המודל המשמש הולם מתארת ​​התקות רדיאלי מבחינת פונקציות בסל שעברו שינוי הנם:
   (1)
   עם , ו
   התנאי מתאים עומק החדירה שנתן,
   .
   מציין פרמטר קשיחות המצע; תקף כאשר גודל מדגם הרבה יותר מעובי המצע. כאן, הפרמטרים, ו בהתאמה לציין את עובי המצע מקדם פואסון. יחס פואסון של המצע אלסטומר סיליקון ¹⁷ הוא ν = 0.5.
4. לקבל פרמטרים דגם אלפא ו β בכל שלב זמן מן הריבועים הפחותים בהתקף של משוואה (1) לפרופיל עקירה רדיאלי.
   1. להעסיק את β הפרמטר ההולם להשיג SC מודולוס האלסטיות, _SC E, באמצעות הביטוי,
      
   2. השתמש α פרמטר הולם להשיג הזמן משתנה stre ייבוש התכווצותss, PSC, באמצעות הביטוי,
      

תוצאות

איור 1 (א) מראה תמונת פלורסנט נציג מדגם SC מצופה חרוזי ניאון (סעיף 3). תמונת האור המועברת המקבילה של המדגם מוצגת באיור 1 (ב) ועליהן מגרש אשפת התקות ייבוש נפתרו מרחבית יוצר לאחר ייבוש 16 שעות ב 25% לחות יחסיים בשל הסימטריה המעגלית של הדגימו?...

Discussion

במאמר זה, אנו מתארים טכניקה שיכולה לשמש כדי למדוד את התנהגות ייבוש דינמי תכונות מכניות של SC האדם. מחקרים קודמים הראו כי טכניקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את ההשפעות של תנאי סביבה ומוצרים כימיים נפוצים ניקוי קוסמטי לחות על התנהגות הייבוש הדינמית של SC ^7,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer base	Dow-Corning	1064291
Silicone elastomer Curing Agent	Dow-Corning	1015311
FluoSpheres Carboxylate 0.1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8803
FluoSpheres Carboxylate 1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8823
FluoSpheres Carboxylate 1 µm nile red fluorescent 535/575	Thermo Fisher	F8819
Trypsin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	T6567
Trypsin inhibitor type II-s	Sigma-Aldrich	T9128
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0294
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P7059
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	E7750
Vortexer mixer	VWR	58816-123
6mm diameter hole punch	Sigma-Aldrich	Z708860
SOLA 6-LCR-SB	Lummencor light engine	No.3526
Cfi Plan Achro Uw 1x Objective	Nikon Plan UW	MRL00012
CFI Plan Fluor 40x Oil Objective 1.3 na - 0.20mm wd	Nikon Plan Fluor	MRH01401
Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon	MEA53200
Clara-E Camera	Andor	DR-328G-C02-SIL
Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design	Nikon	99888
Ti-S-E Motorized Stage	Nikon	MEC56110