Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

Riepilogo

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per in modo completo e quantitativamente studiare il metabolismo di più fonti di nutrienti. Questo flusso di lavoro, basato su una combinazione di tracciante isotopico esperimenti e una procedura analitica, permette il destino dei nutrienti consumati e l'origine metabolica delle molecole sintetizzate da microrganismi deve essere determinato.

Abstract

Studi nel campo della microbiologia si basano sull'attuazione di una vasta gamma di metodologie. In particolare, lo sviluppo di metodi appropriati sostanzialmente contribuisce a fornire una vasta conoscenza del metabolismo dei microrganismi crescono in media chimicamente definite che contengono azoto unico e fonti di carbonio. Al contrario, la gestione attraverso il metabolismo di più fonti di nutrienti, nonostante la loro ampia presenza in ambienti naturali o industriali, rimane praticamente inesplorata. Questa situazione è dovuto principalmente alla mancanza di metodologie, che ostacola le indagini.

Segnaliamo una strategia sperimentale in modo completo e quantitativamente esplorare come metabolismo opera quando una sostanza nutriente è fornito come una miscela di molecole diverse, vale a dire, una risorsa complessa. Qui, descriviamo la sua applicazione per valutare il partizionamento di molteplici fonti di azoto attraverso la rete metabolica di lievito. Il flusso di lavoro combina le informazioni ottenute durante gli esperimenti di tracciante isotopo stabile utilizzando selezionati ¹³C - o ¹⁵N-etichettati substrati. In primo luogo è costituito da fermentazioni parallele e riproducibile sullo stesso supporto, che include una miscela di molecole contenenti N; Tuttavia, una fonte di azoto selezionato è etichettata ogni volta. Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) è implementata per valutare i modelli di etichettatura di composti mirati e per quantificare il consumo e il recupero dei substrati in altri metaboliti. Un'analisi integrata del dataset completo fornisce una panoramica del destino di substrati consumati all'interno delle cellule. Questo approccio richiede un preciso protocollo per la raccolta di campioni – agevolato da un sistema di robot-assistita per il monitoraggio online delle fermentazioni – e il raggiungimento di numerose analisi che richiede tempo. Nonostante questi vincoli, essa ha consentito di comprendere, per la prima volta, il partizionamento di molteplici fonti di azoto in tutta la rete metabolica di lievito. Abbiamo determinato le origini metaboliche di molecole volatili e gli aminoacidi proteinogenici e delucidato la ridistribuzione di azoto da fonti più abbondanti verso altri N-composti.

Introduzione

Intesa come opera di metabolismo microbico è una questione chiave per la progettazione di strategie efficienti per migliorare i processi di fermentazione e modulano la produzione di composti fermentativi. I progressi nella genomica e genomica funzionale in questi ultimi due decenni in gran parte contribuito ad estendere la conoscenza della topologia delle reti metaboliche in molti microrganismi. Accesso a queste informazioni hanno portato allo sviluppo di approcci che mirano per una panoramica completa della funzione cellulare¹. Queste metodologie si basano spesso su un'interpretazione basata su modello di parametri misurabili. Questi dati sperimentali comprendono, da un lato, tassi di produzione e l'assorbimento di metabolita e, d'altra parte, esperimenti di informazioni quantitative intracellulare che sono ottenuti dal tracciante isotopico. Questi dati forniscono informazioni essenziali per la deduzione dell'attività in vivo di diversi percorsi in una rete metabolica definita^2,3,4. Attualmente, le tecniche analitiche disponibili solo attivare la rilevazione accurata di modelli di molecole di etichettatura quando si utilizza un elemento singolo isotopo e possibilmente quando co-etichettatura con due elementi isotopici. Inoltre, sotto la maggior parte delle condizioni di crescita, la fonte di carbonio consiste solo di uno o due-composti. Di conseguenza, approcci basati su ¹³C-isotopica traccianti da substrati di carbonio sono stati ampiamente e correttamente applicati per sviluppare una comprensione completa del carbonio reti metaboliche operazioni^{5,6,7 ,8}.

Al contrario, in molti ambienti naturali ed industriali, la risorsa di azoto disponibile che supporta la crescita microbica è spesso composto di una vasta gamma di molecole. Ad esempio, durante la fermentazione di vino o birra, azoto viene fornito come una miscela di 18 aminoacidi e ammonio alle concentrazioni variabili⁹. Questa matrice di composti N che sono accessibili per anabolismo rende queste condizioni supporti complessi notevolmente diversi da quelli comunemente utilizzati per gli studi fisiologici, in quanto quest'ultimo si ottiene utilizzando un'unica fonte di azoto, in genere di ammonio.

Nel complesso, interiorizzato azoto composti possono essere direttamente incorporati nelle proteine o catabolizzate. La struttura della rete del metabolismo dell'azoto in molti microrganismi, tra cui il lievito Saccharomyces cerevisiae, è molto complessa, secondo la diversità dei substrati. Schematicamente, questo sistema si basa sulla combinazione del nucleo centrale del metabolismo dell'azoto che catalizza l'interconversione di glutamina, glutammato e α-chetoglutarato^10,11, con transaminasi e deaminasi. Attraverso questa rete, sono riuniti gruppi amminici da ammonio o altri aminoacidi e acidi α-cheto rilasciato. Questi intermedi sono anche sintetizzati attraverso il carbonio centrale metabolismo (CCM)^12,13. Questo gran numero di reazioni ramificate e intermedi, coinvolti nel catabolismo di fonti esogene di azoto sia l'anabolismo degli amminoacidi proteinogenici, soddisfa i requisiti anabolizzanti delle cellule. L'attività attraverso questi diversi percorsi interconnessi comporta anche l'escrezione dei metaboliti. In particolare, α-chetoacidi possono essere reindirizzati attraverso il pathway di Ehrlich per la produzione di alcoli superiori e loro acetato estere derivati¹⁴, che contribuiscono in maniera essenziale ai profili sensoriali dei prodotti. Successivamente, come funziona il metabolismo dell'azoto svolge un ruolo chiave nella produzione di biomassa e la formazione di molecole volatili (aroma).

Le reazioni, enzimi e geni coinvolti nel metabolismo dell'azoto sono ampiamente descritti nella letteratura. Tuttavia, il problema della distribuzione delle molteplici fonti di azoto attraverso una rete metabolica non è ancora stato risolto. Ci sono due ragioni principali che spiegano questa mancanza di informazioni. In primo luogo, alla luce della complessità importante della rete di metabolismo dell'azoto, una grande quantità di dati quantitativi è richiesta per una completa comprensione del suo funzionamento che non era disponibile fino ad ora. Secondo, molti vincoli sperimentali e le limitazioni dei metodi analitici ha impedito l'attuazione di approcci che sono stati precedentemente utilizzati per la delucidazione della funzione CCM.

Per superare questi problemi, abbiamo scelto di sviluppare un approccio di livello di sistema che si basa sulla riconciliazione dei dati da una serie di esperimenti di tracciante isotopico. Il flusso di lavoro comprende:
-Una serie di fermentazioni effettuate nelle stesse condizioni ambientali, mentre una diversa fonte di nutrienti selezionata (substrato) è etichettata ogni volta.
-Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) per una determinazione accurata, nelle diverse fasi della fermentazione, la concentrazione residua di substrato con etichetta e la concentrazione e l'arricchimento isotopico di composti che sono derivati da il catabolismo della molecola con etichetta, compresa la biomassa derivata.
-Un calcolo del saldo massa ed isotopico per ciascuno consumati con etichetta molecola e un'ulteriore analisi integrata del set di dati per ottenere una panoramica globale della gestione delle molteplici fonti di nutrienti da parte dei microrganismi attraverso la determinazione dei coefficienti di flusso .

Per applicare questa metodologia, si deve prestare attenzione al comportamento riproducibile del ceppo/microrganismo tra culture. Inoltre, si devono prelevare campioni da diverse culture durante lo stesso progresso di fermentazione ben definito. Nel lavoro sperimentale segnalato in questo manoscritto, un sistema robot-assistita è utilizzato per il monitoraggio online delle fermentazioni per rappresentare questi vincoli.

Inoltre, è fondamentale scegliere un set di substrati con etichettate (composto, natura e posizione di etichettatura) che è opportuno affrontare il problema scientifico dello studio. Qui, arginina, glutamina e ¹⁵N-labeled ammonio sono stati selezionati come le tre fonti principali azoto trovate in succo d'uva. Questo ha permesso di valutare il modello di ridistribuzione di azoto dai composti consumati per gli aminoacidi proteinogenici. Abbiamo anche il compito di indagare sulla sorte della spina dorsale del carbonio di aminoacidi consumati e il loro contributo alla produzione di molecole volatili. Per soddisfare questo obiettivo, uniformemente ¹³C-etichetta leucina, isoleucina, treonina e valina sono stati inclusi nello studio come gli aminoacidi che sono derivati da importanti intermedi del pathway di Ehrlich.

Nel complesso, abbiamo esplorato quantitativamente come lievito gestisce una risorsa complessa azoto ridistribuendo le fonti di azoto esogene per soddisfare le proprie esigenze anabolizzanti per tutta la fermentazione mentre inoltre rimuovono l'eccesso di precursori di carbonio come molecole volatili. La procedura sperimentale riferita in questa carta può essere applicata per studiare altre fonti di nutrienti più utilizzati da qualsiasi altro microrganismo. Sembra essere un approccio adeguato per l'analisi dell'impatto del background genetico o condizioni ambientali sul comportamento metabolico dei microrganismi.

Protocollo

1. fermentazione e campionamento

1. Preparazione dei media e fermentatori
   Nota: Tutte le fermentazioni vengono svolte in parallelo, utilizzando lo stesso sforzo e nello stesso chimicamente definite mezzo sintetico (SM, composizione indicati nella tabella 1), che include una miscela di ammonio e gli aminoacidi come fonti di azoto¹⁵. Per ogni fermentazione, un composto unico azoto viene fornito esclusivamente in un uniformemente con etichetta ¹³C o ¹⁵N modulo (100%), mentre gli altri rimangono senza etichetta. Per ogni fonte di azoto con etichetta utilizzata nel set di esperimenti (qui: ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-Gln, U -¹³C6-Leu, U -¹³C5-Val, U -¹³C6-Ile, U -¹³C4-Thr), due fermentatori sono preparati. Per ogni condizione, duplicata fermentazione viene eseguita utilizzando soltanto le molecole senza etichetta (fermentazioni 7 controllo).
   1. Per ogni N-origine per essere studiato, preparare 500 mL di SM mezzo che contiene tutte le fonti di azoto elencate nella tabella 1, fatta eccezione per il composto da utilizzarsi in 100% con etichetta forma.
      Nota: La molecola con etichetta viene aggiunto nei passaggi successivi.
   2. Pastorizzare ogni mezzo in un pallone da 1 L (10 min, 100 ° C) contenente una barra di agitazione magnetica. Pesare la quantità appropriata di molecola con etichetta per raggiungere la concentrazione finale che è riportata nella tabella 1 e scioglierla nel mezzo.
   3. Sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di filtrazione sotto vuoto monouso (membrana in acetato di cellulosa, da 0,22 µm). Utilizzando un cilindro graduato sterile, dividere la via di mezzo tra due fermentatori pre-sterilizzati (250 mL) contenenti una barra agitazione magnetica e sono dotate di serrature di fermentazione per evitare l'entrata di ossigeno, ma consentire il rilascio di CO₂.
   4. Le beute di fermentazione a 28 ° C di calore ponendoli nella camera di incubazione per 1 notte (temperatura impostata a 28 ° C).
2. Inoculazione e monitoraggio delle fermentazioni
   1. Crescere il S. cerevisiae ceppo in provette sterili contenenti 10 mL di terreno YPD a 28 ° C con agitazione (150 rpm) per 12 h. Quindi, dispensare 1 mL di YPD preculture e trasferirlo in 10 mL di terreno di SM (in provette sterili da 15 mL). Incubare la cultura per 12 ore a 28 ° C con agitazione (150 rpm).
   2. Sotto flusso laminare, raccogliere una coltura aliquota e quantificare la popolazione delle cellule utilizzando un contatore di particelle elettroniche che è dotato di un'apertura di µm 100. Centrifugare la coltura (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) e sospendere il pellet in un volume adeguato di acqua sterile per ottenere una concentrazione finale di 2,5 x 10⁸ cellule/mL. Inoculare ogni fermentatore con 1 mL di sospensione cellulare.
      Nota: Il sistema robotico utilizzato per monitorare l'avanzamento di fermentazione è descritto nella Figura 1.
   3. Preparare la piattaforma di fermentazione installando i fermentatori nelle guide di supporto che sono correttamente collocate sulle piastre agitazione 21-posizione e impostare la velocità di agitazione a 270 giri/min. Per avviare il monitoraggio on-line di ogni fermentazione, lanciare l'applicazione di controllo del robot, quindi fare clic sul pulsante "start test" e selezionare il volume di fermentazione da effettuarsi (300 mL).
   4. L'interfaccia visualizzata permette l'indicazione del numero e la posizione di fermentatori sulla piattaforma. Per garantire che ciò si verifica, fare clic con il pulsante destro sulla posizione dello slot e scegliere "attiva" per attivare il monitoraggio del fermentatore che si trova in questa posizione.
   5. Inizializzare il software di calcolo, permanentemente in esecuzione sul sistema, prima di iniziare l'acquisizione di peso. Fare clic sul pulsante "Initialiser" e confermare con "ok". Fare clic sul pulsante"Start" dell'applicazione controllo di robot per iniziare le acquisizioni di peso.
3. Procedura di campionamento
   Nota: Per ogni fermentatore, vengono prelevati campioni quando la produzione di CO₂ (valore indicato on-line sul computer che esegue il software di calcolo) raggiunge il set-point richiesto: 5, 10, 40 e 90 g/L in questo studio.
   1. Procedura per le culture con composti con etichettate di campionamento.
      1. Centrifughi i due campioni di 6 mL (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Salvare e memorizzare i surnatanti congelati in due aliquote a-80 ° C. Lavare il pellet due volte con 5 mL di acqua distillata e conservare a-80 ° C per la misurazione degli arricchimenti isotopici.
   2. Procedura per culture senza composti con etichettate di campionamento
      1. Raccolta 10 mL di coltura, che verrà utilizzato per la determinazione del peso secco. Appallottolare le celle da due campioni di 10 mL per centrifugazione (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Lavare il pellet due volte con 10 mL di acqua distillata e conservarli a-80 ° C per la determinazione del contenuto di proteine e aminoacidi.

2. quantificazione delle fonti di azoto consumato

1. Determinazione enzimatica delle concentrazioni di ammoniaca residua
   Nota: La determinazione della concentrazione di ammoniaca in surnatanti viene effettuata utilizzando un kit commerciale basato su enzima; tutti i reagenti sono forniti dal produttore.
   1. Preparare una soluzione di ammoniaca standard (61,4 mg/L) sciogliendo così 25 mg di precisamente pesato (NH₄)₂₄ in un matraccio tarato da 100 mL.
   2. Per soddisfare le istruzioni del produttore, eseguire una diluizione di 1:2 dei campioni che sono state prese prima della fermentazione e a 5 g/L di CO₂ rilasciato. Regolare il pH dei campioni a circa 8 con l'aggiunta di 1 M di KOH. Prendere nota del volume aggiunto e prendere in considerazione il fattore di diluizione.
   3. In cuvette spettrofotometro di 4ml, mix 100 µ l di campione (diluito se necessario), acqua distillata o soluzione standard di ammoniaca con 2 mL di reagente 1 (0,75 mM ADP e della deidrogenasi del glutammato a 30 U/mL in tampone a pH 7,8) e 500 µ l di reagente 2 (NADH 1,3 mM). Incubare per 15 min a temperatura ambiente e leggere l'assorbanza del NADH a 340 nm (A1).
   4. Aggiungere 500 µ l di Reagente 3 (60 mM α-chetoglutarato in tampone a pH 8), incubare il campione per 20 min a temperatura ambiente e leggere l'assorbanza del NADH a 340 nm (A2).
   5. Calcolare la concentrazione di ammoniaca utilizzando:
      C_ammoniaca (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)_campione- (0.839 x A1-A2)_{acqua distillata}]
   6. Verificare che la concentrazione corretta è ottenuta con la soluzione standard.
2. Determinazione cromatografica delle concentrazioni di residui dell'amminoacido
   Nota: La determinazione delle concentrazioni di aminoacidi in surnatanti è realizzata utilizzando un sistema di analisi dell'amminoacido dedicato che si basa sulla cromatografia di scambio ionico con derivatizzazione di colonna post di N-composti con ninidrina, che permette loro rilevazione colorimetrica.
   1. Preparare una soluzione di riferimento con l'aggiunta di 200 µ l di una miscela commerciale degli aminoacidi neutri e acidi, 200 µ l di una miscela commerciale di amminoacidi basici e 200 µ l di glutammina 2,5 mM a 400 µ l di tampone citrato del litio di 200 mM, pH 2.2. Questa soluzione di riferimento chimicamente definito viene trattata come un campione.
   2. Aggiungere 200 µ l di soluzione di acido solfosalicilico 25% (p/v) contenente 2,5 mM norleucine (standard interno) a 800 µ l di campione per rimuovere molecole ad alto peso molecolare. Incubare per 1 h a 4 ° C, centrifuga (3.000 x g, 10 min, 4 ° C) e filtrare attraverso una membrana di nitrocellulosa dimensioni dei pori di 0.22 µm (sistema a siringa).
   3. Nel software programmatore, fate clic sul pulsante "Esegui" per iniziare la cromatografia liquida (LC) analisi con l'analizzatore dotato di una colonna di scambio cationico (modulo di litio). Eluire gli aminoacidi con buffer di litio successivi per creare un gradiente di pH e una sfumatura in concentrazione di contro-ioni in combinazione con un gradiente di temperatura (tabella 2).
   4. Quantificare i composti di azoto dopo derivatizzazione di ninidrina da un rivelatore spettrofotometrico a 570 nm (viola colorazione: reazione tra ninidrina e ammina gruppo di amminoacidi) e 440 nm (colorazione gialla: reazione tra gruppo di ninidrina e immina prolina).
   5. Eseguire una calibrazione interna di singolo-punto utilizzando la soluzione di riferimento e norleucine come standard interno per calcolare le concentrazioni di aminoacidi nei campioni utilizzando il software del produttore.

3. quantificazione degli aminoacidi proteinogenici

1. Misurazione del peso a secco delle cellule
   1. Filtro 10ml di cultura attraverso un filtro di nitrocellulosa (poro dimensioni 0,45 µm) che è pre-pesato in una tazza di alluminio, utilizzando un dispositivo di vuoto. Lavare due volte con 50 mL di acqua distillata.
   2. Inserire il filtro nella tazza in alluminio e asciugare in forno a calore a 105 ° C per 48 h (fino a quando non si osserva nessun ulteriore cambiamento nel peso) prima di ripesare il filtro nella tazza. Calcolare la differenza di peso.
   3. Calcolare la media di almeno 3 misurazioni indipendenti per determinare con precisione il peso di pila a secco della cultura lievito.
2. Quantificazione del tenore di proteine delle cellule
   Nota: La quantificazione della frazione proteica delle cellule viene eseguita almeno in triplice copia utilizzando palline di adenoide delle cellule che sono state ottenute come descritto in sezione 1.3.2.
   1. Estrarre proteine con aggiunta di 1 mL di soluzione di DMSO (50% v/v) di pellet congelati e incubare a 105 ° C per 1 ora in forno a calore secco.
   2. Quantificare il contenuto di proteine negli estratti di DMSO utilizzando il saggio colorimetrico biochimico che si basa sulla riduzione di proteine di Cu +⁺ in ioni Cu⁺ , che sono ulteriormente precipitati dall'acido bicinconinico in un complesso blu (analisi di BCA).
3. Determinazione dei contributi relativi di amminoacidi in proteine
   Nota: Il profilo degli aminoacidi proteinogenici è determinato almeno in triplice copia da palline delle cellule senza etichetta (1.3.2.).
   1. Preparare un estratto ossidato sospendendo il pellet cellulare in 200 µ l di acido performico (acido formico 90%, 10% di perossido di idrogeno). Incubare per 4 h a 4 ° C e interrompere la reazione con l'aggiunta di solfato di sodio 33,6 mg.
      Nota: Il passaggio di ossidazione è richiesto per convertire cisteina e metionina in acido del solfone e cisteico metionina, che sarà ulteriormente quantificato dalla cromatografia di scambio ionico. Tuttavia, alcuni amminoacidi (tirosina, fenilalanina, istidina e arginina) sono denaturate durante il trattamento di ossidazione. Di conseguenza, vengono preparati due idrolizzati (con e senza ossidazione).
   2. Aggiungere 800 µ l di HCl 6N a palline delle cellule o ossidato estratto e incubare il campione in un tubo di vetro sigillato ermeticamente per 16 h a 110 ° C in forno a calore secco. Aggiungere 200 µ l di 2,5 mM norleucine e rimuovere HCl con un flusso di azoto. Lavare (risospendere l'Estratto secco e quindi rimuovere il liquido con un flusso di azoto), due volte con 800 µ l di acqua distillata e poi con 800 µ l di etanolo. Richiedere fino a 800 µ l di tampone di 200 mM al litio acetato, pH 2.2.
      Nota: Attenzione dovrebbe essere pagato per il tempo di incubazione per l'idrolisi alcuni amminoacidi non sono stabili in condizioni acide. La frazione di triptofano in proteina è stimata dai dati trovati in letteratura¹⁶, come questo aminoacido è completamente denaturato durante l'idrolisi di HCl.
   3. Predisporre un idrolizzato standard per la taratura interna di singolo-punto. Aggiungere 160 µ l di una soluzione commerciale di amminoacidi idrolizzati a 840 µ l di tampone di 200 mM al litio acetato, pH 2.2, che contiene 625 del solfone di metionina µM, 625 acido cisteico µM e 625 norleucine µM.
   4. Determinare le concentrazioni relative di amminoacidi in proteine usando il metodo cromatografico descritto nella sezione 2.2.
4. Calcoli
   1. Calcolare la percentuale in peso di ciascun amminoacido in proteine dividendo la quantità misurata di ciascun amminoacido (mg/L) dalla quantità totale di aminoacido che è stata misurata nell'estratto della proteina (somma in mg/L).
   2. Moltiplicare questa percentuale per la concentrazione delle proteine in cultura (mg/L), vale a dire, il prodotto tra il contenuto proteico della biomassa e il peso secco, di valutare la concentrazione di ciascun amminoacido proteinogenici nella cultura (mg/L).

4. misurazione di arricchimento isotopico di aminoacidi proteinogenici

Nota: Per la misurazione di arricchimento isotopico di aminoacidi proteinogenici, utilizzare il pellet cellulare con etichetta. Tre diversi agenti sono utilizzati per il passaggio di derivatizzazione di quantificare l'arricchimento isotopico di aminoacidi. Le intensità di ioni cluster sono misurate per stimare i modelli di etichettatura degli aminoacidi. Il segnale da ogni ione cluster corrisponde all'abbondanza della massa isotopomers (m₀ = senza etichettatura, m_{+ 1} = 1 atomo con etichetta,...) di un frammento dell'amminoacido. Nella Figura 2è riportato un esempio di un cromatogramma ottenuto dopo la procedura DMADMF.

1. Idrolisi di biomassa
   1. Idrolizzare il pellet cellulare (corrispondente a 1-2 mg di biomassa secca) aggiungendo 1,2 mL di 6 M HCl e incubando il campione per 16 ore a 105 ° C in tubi di vetro ermeticamente chiuso in un forno a calore secco.
   2. Aggiungere 1,2 mL di acqua distillata e centrifugare a 3.000 x g per 5 min rimuovere i detriti cellulari. Distribuire il supernatante in frazioni di sei 400 µ l in tubi di vetro aperto. Asciugare le frazioni in forno a calore a 105 ° C fino a raggiungere la consistenza di sciroppo (4-5 h).
2. Derivatizzazione Ethylchloroformate (ECF)
   1. Sciogliere l'idrolizzato essiccata in 200 µ l di 20mm HCl; quindi, aggiungere 133 µ l di piridina: etanolo (1:4). Aggiungere 50 µ l di ECF di derivatizzare gli aminoacidi e aspettare fino a quando tutte le CO₂ è stato rilasciato. Trasferire il composto per Centrifugare le provette contenenti 500 µ l di diclorometano per estrarre i composti derivatizzati.
   2. Vortex le provette per 10 s e centrifugare per 4 min a 10.000 x g; raccogliere la fase organica inferiore con una pipetta Pasteur e trasferimento a fiale di GC che contengono inserti in vetro conico, in modo che i campioni possono essere iniettati direttamente nello strumento GC/MS.
3. (N, N)-derivatizzazione di dimetilformammide dimetil acetale (DMFDMA).
   1. Sciogliere l'idrolizzato secco in 50 µ l di metanolo e 200 µ l di acetonitrile. Aggiungere 300 µ l di DMFDMA. Vortice del tubo e trasferimento ai campioni di autocampionatori GC fiale che contengono inserti in vetro conico.
4. N, derivatizzazione trifluoroacetamide (BSTFA) O-Bis (trimetilsilile)
   1. Sospendere l'idrolizzato in 200 µ l di acetonitrile. Aggiungere 200 µ l di BSTFA, chiudere ermeticamente il tubo di vetro ed incubare per 4 h a 135 ° C prima di trasferire l'estratto direttamente al GC fiale.
5. Analisi GC-MS
   1. Analizzare i campioni con un cromatografo a gas che è dotato di un iniettore di autocampionatori ed è accoppiato ad uno spettrometro di massa.
      1. Utilizzare software specifici dello strumento di controllo dello strumento e analizzare i cromatogrammi. Nel menu "Sequenza", fare clic su "Tabella del Log di esempio" per creare l'elenco di esempio e fare clic sul pulsante "Esegui" per iniziare le iniezioni.
         Nota: Il cromatografo a gas è dotato di una colonna capillare in silice apolari 30 m x 0,25 mm con una spessore 0.15 μm. Impostare la temperatura di spettrometro di massa quadrupolare a 150 ° C e tenere la linea di trasferimento a 250 ° C per tutte le analisi. Tre programmi di analisi, ogni uno specifico di ogni agente di derivatizzazione, vengono utilizzati.
      2. Derivati ECF: Utilizzo dell'elio come fase mobile con una portata di 1,2 mL/min imposta la temperatura dell'ingresso a 230 ° C e quello della sorgente a 250 ° C. Programmare l'autocampionatore per iniettare 1 µ l di campioni con un rapporto di divisione di 3:1. Eseguire le analisi, aumentando gradualmente la temperatura del forno come indicato di seguito: 130 ° C per 3 min; pendenza di 15 ° C/min fino a 260 ° C; mantenere la temperatura a 260 ° C per 20 min.
      3. Derivati DMFDMA: Utilizzo dell'elio come fase mobile con un flusso costante di 1,2 mL/min. imposta la temperatura dell'ingresso a 230 ° C e quello della sorgente a 250 ° C. Programmare l'autocampionatore per iniettare 1 µ l di campioni con un rapporto di divisione di 3:1. Eseguire le analisi, aumentando gradualmente la temperatura del forno come segue: 60 ° C per 1 min; pendenza di 20 ° C/min fino a 130 ° C; secondo gradiente di 4 ° C/min fino a 260 ° C; mantenere la temperatura a 260 ° C per 10 min.
      4. Derivati BSTFA: Utilizzo dell'elio come fase mobile con un flusso costante di 1,2 mL/min. imposta la temperatura dell'ingresso a 275 ° C e quello della sorgente a 300 ° C. Eseguire le analisi (iniezione: 1 µ l), gradualmente aumentando la temperatura del forno come segue: 110 ° C per 1 min; primo gradiente di 2 ° C/min fino a 154 ° C; secondo gradiente di 5 ° C/min fino a 300 ° C; mantenere la temperatura a 300 ° C per 10 min.
      5. Procedura di rilevazione: Per ogni modalità di derivatizzazione, iniettare un campione (1 µ l) in modalità di scansione con ionizzazione di effetto elettrone positivo a 70 eV e prendere nota del tempo di ritenzione di ciascun amminoacido.
      6. Utilizzare questi valori per definire le finestre di tempo in tutto il cromatogramma e per i diversi ioni selezionati, che sono caratteristici di ciascun amminoacido ed elencati in tabella 3; questi valori devono essere inclusi per ogni amminoacido. Includere questa informazione nel programma di rilevamento di SIM ed eseguire le analisi in modalità SIM con ionizzazione di effetto elettrone positivo a 70 eV.
   2. Raccogliere i risultati delle analisi; vale a dire, per ogni amminoacido, è possibile registrare un cluster di intensità che corrispondono al suo isotopomers di massa diversa. Elaborare i dati utilizzando il dedicatedsoftware¹⁷ per correggere per l'etichettatura di naturale e calcolare l'arricchimento isotopico di aminoacidi proteinogenici (definita come la frazione con etichetta di un amminoacido rispetto al suo importo totale nella proteina campioni).
      Nota: L'arricchimento isotopico di una molecola (cioè), espressa in percentuale, viene calcolato dividendo la somma delle intensità corretta della massa isotopomers con etichettatura (m₁, m₂,... m_n) la somma del corretto intensità di tutti i isotopomers massa (m₀, m₁, m₂,... m_n):
      Cioè = (m₁ + m₂ +... + m_n) / (m₀ + m₁e m₂ +... + m_n)

5. quantificazione e arricchimento isotopico di composti volatili

1. Estrazione di composti volatili con etichettati
   1. Aggiungere 10 µ l di standard interni deuterati a 5 mL di surnatante (concentrazione finale di composti deuterati: 100 µ g/L) in una provetta di vetro da 15 mL. Aggiungere 1 mL di diclorometano, strettamente chiudere le provette e agitarle su una piattaforma a dondolo per 20 min. Centrifugare per 5 min 3.000 x g e raccogliere la fase organica inferiore in una provetta di vetro da 15 mL. Ripetere l'estrazione di diclorometano.
   2. Asciugare l'Estratto organico più di 500 mg di solfato di sodio anidro e raccogliere la fase liquida con una pipetta Pasteur. Concentrare l'Estratto da un fattore di quattro sotto flusso di azoto e trasferirlo in un flaconcino di autocampionatori GC.
2. GC-MS quantificazione dei composti volatili
   1. Dotare il cromatografo a gas con una colonna capillare in silice fusa 30 m x 0,25 mm di spessore 0,25 μm e applicare un flusso di elio costante di 1,0 mL/min attesa l'iniettore e la linea di trasferimento a 250 ° C.
   2. Iniettare 2 µ l di campione con un rapporto di divisione di 10:1 e separare le molecole volatili estratte utilizzando il seguente profilo di temperatura del forno: tenere la temperatura per 3 min a 40 ° C, aumentare di 4 ° C/min fino a 220 ° C e poi tenere il forno a 220 ° C per 20 min.
   3. Rilevare i composti utilizzando uno spettrometro di massa con la sua temperatura di origine impostato a 230 ° C e la sua temperatura di spettrometro di massa quadrupolare a 150 ° C. Registrare spettri di massa in modalità selezionata Ion Monitoring (SIM) con ionizzazione di effetto elettrone positivo a 70 eV e con i grappoli di ioni specifici per le sostanze volatili che sono riportati nella tabella 4.
   4. Utilizzare una taratura esterna di 7 punti per quantificare le concentrazioni di molecole volatili le somme delle intensità del cluster dello ione corrispondente. Preparare soluzioni di riserva di ogni composto (10 g/L) in etanolo al 100%. Quindi, preparare soluzioni standard per ciascuna classe di molecole volatili (esteri etilici, acetati, alcoli e acidi) con soluzioni di riserva. Infine, diluire gli importi differenti di soluzioni standard in una soluzione idroalcolica di 12% contenente 5 g/L in acido tartarico con il pH regolato a 3.3 per preparare soluzioni di taratura.
   5. In parallelo, correggere per l'etichettatura naturale delle intensità di ogni cluster di ioni e calcolare l'arricchimento isotopico di composti volatili, che è definita come la frazione con etichetta delle molecole ed è espresso come una percentuale utilizzando il software dedicato ¹⁷.

6. calcoli per un'analisi integrata del Dataset

1. Raccolta dei dati grezzi
   1. Utilizzando i fogli di calcolo riportati nelle tabelle 5, 6, 7 e 8, immettere i valori di dati grezzi che corrispondono alla concentrazione di aminoacidi extracellulari, peso a secco delle cellule, contenuto proteico delle cellule, concentrazione di molecole volatili e isotopica arricchimento di aminoacidi proteinogenici e molecole volatili.
      Nota: I dati riportati nelle tabelle sono espresse in mM. Tutti i risultati sono anche espressi in mg/L, moltiplicando i valori in mM per il peso molecolare di ogni molecola o in mg N/L moltiplicando la concentrazione millimolar di un aminoacido proteinogenici per la massa atomica dell'azoto (14 ore) e dal numero di azoto ato MS che sono forniti da catabolismo di questa molecola.
   2. Calcolare la percentuale in massa di ciascun amminoacido in proteine dividendo la quantità in mg/L nell'idrolizzato dalla quantità totale di aminoacidi (loro somma in mg/L).
   3. Calcolare i mezzi, deviazioni standard ed errori standard della media dai dati che sono stati ottenuti negli esperimenti indipendenti.
   4. Calcolare la concentrazione di proteinogenici (mg/L) per ogni amminoacido moltiplicando la percentuale di questo aminoacido in proteine (mg aa/g proteine) con la frazione proteica della biomassa (g proteine/g DW) e il tenore di peso a secco (produzione di biomassa) nella media (g DW/L).
2. ¹⁵ Esperimenti di tracciante isotopico di N
   1. Utilizzando i fogli di calcolo sono presentati in tabella 9, calcolare le frazioni marcate e non marcate di azoto che sono presenti negli amminoacidi proteinogenici (espressi in mg N/L) da loro concentrazioni totali (espressi in mg N/L) e loro arricchimenti isotopici. Per ogni amminoacido, la frazione con etichetta corrisponde al prodotto tra la sua concentrazione totale e relativo arricchimento isotopico, e la parte senza etichetta è la differenza tra il totale e gli importi con etichettati.
   2. Quindi, determinare la frazione di azoto totale in proteine che è contenuto in amminoacidi proteinogenici quantificati in questo studio sommando la quantità totale di Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, la sua, Glu e Arg (in mg N/L) e dividendo il totale un Monte di azoto contenuto in proteine di questa somma.
   3. Calcolare l'azoto fornito da arginina, glutamina o ammonio che è stato recuperato negli acidi proteinogenici quantificati in questo studio sommando la frazione con etichetta (in mg N/L) di aminoacidi proteinogenici che sono stati quantificati nello studio (Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, suo, Glu e Arg) durante gli esperimenti in presenza di ¹⁵N-etichettato arginina, glutamina, o ammonio e dividendo questa frazione di azoto con l'etichetta per la quantità totale di azoto nel quantificati proteinogenici amino acidi.
   4. Valutare il contributo di 3 aminoacidi più abbondanti al pool intracellulare dell'azoto utilizzato per la biosintesi de novo combinando i dati dal ¹³C ed esperimenti di ¹⁵N isotopo tracciante (foglio di calcolo nella tabella 7).
   5. Dall'importo totale (espressa in mM) di proteinogenici Val, Leu, Ile o Thr, detrarre la parte derivata dall'incorporazione diretta di composti consumati (¹³C esperimenti) e la parte che è stato sintetizzato de novo utilizzando l'azoto dai 3 principali fonti al fine di valutare la frazione che è stato sintetizzato de novo utilizzando azoto da altri aminoacidi.
   6. Quindi, calcolare il rapporto tra la quantità di aminoacidi de novo sintetizzato utilizzando azoto fornito da Gln, Arg e NH₄⁺ (somma espressa in mM) per la quantità totale di aminoacidi proteinogenici (in mM) per quantificare il contributo di arginina, glutamina e ammonio al pool di azoto intracellulare.
3. ¹³ Esperimenti di tracciante isotopico di C
   1. Calcolare le frazioni marcate e non marcate degli aminoacidi proteinogenici dalle concentrazioni espresse in mM e arricchimenti isotopici di aminoacidi proteinogenici che sono stati ottenuti durante gli esperimenti in presenza di ¹³C-etichetta Leu, Val, Ile o Thr. (Vedi 6.2.1, tabella 10).
   2. Calcolare le frazioni marcate e non marcate di composti volatili dalle concentrazioni espresse in mM e arricchimenti isotopici di composti volatili che sono stati ottenuti durante gli esperimenti in presenza di ¹³C-etichetta Leu, Val, Ile o Thr ( Tabella 10).

Risultati

Figura 3 presenta un diagramma schematico del flusso di lavoro che è stato implementato per studiare la gestione da lievito delle molteplici sorgenti di azoto che si trovano durante la fermentazione del vino.
Per i diversi punti di campionamento, le caratteristiche di parametri – crescita biologica, modelli di consumo di azoto e il profilo di aminoacidi proteinogenici – Visualizza un'elevata riproducibilità tra fermentazioni (Fig...

Discussione

Quantificare il partizionamento di composti attraverso reti metaboliche mediante esperimenti di tracciante isotopico è un promettente approccio per capire il funzionamento del metabolismo microbico. Questa metodologia, mentre applicato con successo con uno o due substrati con etichettati, attualmente non può essere implementata per studiare il metabolismo di varie fonti utilizzando multipli con etichettati elementali isotopi (cioè, più di due substrati). Infatti, le tecniche analitiche disponibili consentono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702