時空ゲスト活性型タグとしてケージの分子接着剤を用いた生細胞内の核内移行を制御

要約

このプロトコルでは、ケージ分子接着剤タグを使用して生きている細胞での核内移行を光トリガーについて説明します。このメソッドは、サイト選択的核ターゲット ドラッグデリバリーの有望です。

要約

細胞核は、遺伝子の複製の変調から最も重要な細胞内小器官の一つを細胞内薬物送達ターゲットとして、式は様々 な疾患の治療に有効です。ここでは、光トリガー核移行を利用するお客様のケージが複数のためイオン (Gu⁺) ペンダント (酪酸置換アニオン光分解性グループによって保護されて分子接着剤 (^ケージ接着剤 R) タグを紹介します。nitroveratryloxycarbonyl;^BANVOC)。^{ボールリテーナ入り}接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソームのまま。しかし、光照射に伴い、^{ボールリテーナ入り}接着剤-R がアンケージ分子接着剤 (^Uncaged接着剤-R) 複数の区⁺ペンダントを運ぶエンドソーム脱出とゲストの後の核移行を容易にするに変換されます。このメソッドは、タグ付けのお客様は細胞核に続いて細胞質に移行できますので核ターゲット サイト選択の薬物送達のための有望な場合にのみ長。^ケージ接着剤 R タグは、小分子のお客様だけでなく、量子ドット (Qd) など高分子のゲストを提供できます。^ケージ接着剤 R タグは紫外線だけでなく、組織に深く浸透することができます, 二光子励起近赤外線 (NIR) ライトとケージですることができます。

概要

遺伝情報を運ぶ、細胞核の 1 つ最も重要な細胞内小器官細胞内薬物送達ターゲットとして遺伝子複製の変調から式は、がんを含むさまざまな病気の治療に有効と遺伝^{1,2,3 を}障害します。薬のデリバリー、ペプチドの活用は、ような核局在化信号 (NLS)^4,5,6が広く検討されているタグを付けます。ただし、望ましくない副作用を減らすために核移行の時空間的制御が必要です。

以前は、ケージ NLS^7,8,9を使用して、細胞の核蛋白質の光トリガー転流を実現しています。NLS は、⁶細胞質輸送タンパク質に結合して細胞核に移行します。報告の方法でケージの NLS を軸受ゲスト蛋白質はマイクロインジェクション⁸で細胞質に組み込まれてまたは遺伝コードの拡張手法⁹を使用してターゲット細胞で発現直接。したがって、細胞内取り込みと光誘起核移行を実現できる手法は実用的なアプリケーションのために有利です。

ここで、細胞樹状突起のケージ分子接着 (^{ボールリテーナ入り}接着剤-R は、図 1) タグを使用してお客様の核内移行を光トリガーをについて説明します。水溶性の分子接着剤^{10、11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,}タンパク質^{11,12,13,14,15、しっかりと接着した23複数区+ペンダントをベアリングが以前開発されています。 16,17}, 核酸^18,19、20、リン脂質膜²¹、そして粘土ナノシート^22,23を通じて、複数の塩橋区⁺ペンダントとターゲットにされグループの形成。^{ボールリテーナ入り}接着剤-R の区⁺ペンダントは光分解性陰イオン グループ、酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) によって保護されています。^{ボールリテーナ入り}接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソーム (図 2) でご滞在。光照射に伴い、^{ボールリテーナ入り}接着剤-R の^BANVOC グループは、アンケージ分子接着剤 (^Uncaged接着剤-R) 複数の区⁺ペンダントを運ぶタグ ゲストの移行を容易に屈する戸建します。細胞質は細胞核 (図 2) が続きます。^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグが紫外線や深刻な毒性なし二光子励起近赤外線 (NIR) ライトへの露出によってケージですることができます。高分子のお客様だけでなく、小分子^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグ量子ドット (Qd) と蛍光色素 (nitrobenzoxadiazole; を使用してお客様の時空制御の核配信を紹介します。NBD) の例として、それぞれ。

^{ボールリテーナ入り}接着剤-R の図 1: 概略構造^{ボールリテーナ入り}接着剤-R の 9 のためのイオン (Gu⁺) ペンダントが酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) グループによって保護されています。^BANVOC グループは二光子励起近赤外光照射によって裂かれます。^{ボールリテーナ入り}接着剤研究の焦点のコアは nitrobenzoxadiazole (NBD) または dibenzocylooctyne (DBCO) のいずれかで修飾します。参照²⁰から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: お客様の核内移行を光トリガーの模式図^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグを持つ共役します。ゲスト/^{ボールリテーナ入り}接着剤 R 共役は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスを介して。光照射に伴い、^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグはタグ ゲストのエンドソーム脱出を容易にすることができます^Uncaged接着剤 R タグを生成するケージではありません。その後、タグ付けのゲストは、細胞核に移行します。参照²⁰から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

プロトコル

1. 接着剤-R の^ケージでお客様の準備のタグします。

1. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD ソリューションを準備します。
   1. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD (図 1) を次の手順に説明した²⁰を合成します。
   2. 乾燥ジメチルスルホキシド (DMSO) で^{ボールリテーナ入り}接着剤-NBD (10 mM) の原液を準備します。
      注: は、暗闇の中で原液を保存します。ソリューションは、水性バッファーまたは使用時の細胞培養媒体で希釈することができます。
2. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 QD ソリューションを準備します。
   1. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 dibenzocylooctyne (^{ボールリテーナ入り}接着剤-DBCO) の合成 (図 1)²⁰以前の手順を説明します。
   2. 乾燥 DMSO の^{ボールリテーナ入り}接着剤-DBCO (10 mM) の原液を準備します。
   3. ^{ボールリテーナ入り}接着剤-量子ドットの作製、アジ化修飾ドット (アジ化量子ドット; をまず準備します。図 3)。DMF の 400 μ L に 100 μ L のアジド PEG4 NHS エステル (図 3) のジメチル ホルムアミド (DMF、125 μ M) ソリューションを追加 (500 nM) アミン修飾 PEG (アミン QD; でコーティングされた量子ドット (Qd) のソリューション図 3)。室温で 1 h の混合物をかき混ぜなさい。
   4. 24 h 3,500 分子量カットオフ (MWCO) で再生セルロース膜を使用して DMF の 800 mL に対しての得られた溶液を dialyze します。
   5. ^{ボールリテーナ入り}接着剤-DBCO 50 μ m に DMF の原液を希釈します。後透析液 (図 3) にソリューションの 200 μ L を追加し、室温で 3 h の混合物をかき混ぜなさい。
   6. 再生セルロース膜 (25,000 MWCO) を使用して DMF の 800 mL に対して 24 時間の結果のソリューションを dialyze します。
   7. 200 に得られた溶液を希釈 DMF の nM。

図 3:^{ボールリテーナ入り}接着剤-量子ドットの作製の模式図.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

2. 顕微鏡観察の Hep3B 細胞サンプルの調製

1. イーグル最小必須培地 (実装された EMEM) 37 ° C で 5% 未満 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む人間の肝細胞癌 Hep3B 細胞を維持 CO₂。
2. 種細胞実験の前日。実装された EMEM の 8 室のガラス基板のウェルあたりの種子 5.0 × 10³ Hep3B 細胞 (10 %fbs、200 μ L)、37 ° c 未満 5% 細胞サンプルをインキュベートと 24 h の CO₂ 。
3. 培を取り外してダルベッコ リン酸バッファー生理食塩水 (D-PBS) 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。

3. 紫外線によって引き起こされる小分子ゲストの核移行の観察

1. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD を含む無料の FBS EMEM の 200 μ L でセルのサンプル (の準備ステップ 2.3) を供給 (10 μ M) 37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベートして 3 h の CO₂ 。
   注意: FBS 無料 4 h 以上実装された EMEM の細胞サンプルの培養は、深刻な細胞の損傷を引き起こします。
2. 培を削除、D pbs 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。
3. エンドソームの可視化、実装された EMEM の 200 μ L でセルのサンプルを供給 (10 %fbs) 赤色蛍光色素が含まれている (例えばLysoTracker 赤、100 nM)、37 ° C で結果のセルのサンプルをインキュベートし、5% 未満 20 分の CO₂を削除、文化媒体とすすぎ 2 回 D pbs 100 μ L でセルのサンプル。EMEM の 200 μ L で細胞サンプルを供給 (10 %fbs)。
4. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD の核移行は、UV ライト 2 分で365 nm バンドパス フィルター搭載 100 W キセノン光源を用いた光ファイバーにセルのサンプルを公開します。紫外線露出なし参照セルのサンプル、暗闇の中でセルのサンプルを保ちます。
   注: ガラス基板上の蓋は、効率的な紫外線露出のため撮影することができます。紫外線に長時間露光は、細胞に細胞毒性を引き起こす可能性があります。
5. 核の可視化、培養液にヘキスト 33342 (1 mg/mL) の 1 μ L を追加し、37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベート 10 分の CO₂ 。
6. 共焦点レーザ走査型顕微鏡の細胞サンプルを対象し、励起 488 で顕微鏡写真を記録 nm (λ_obs = 500 530 nm)、543 nm (λ_obs = 565 620 nm)、および 710 nm (光子;Λ_obs = 390-465 nm)、NBD、赤い蛍光染料、ヘキスト 33342、それぞれ。

4. 小分子ゲスト二光子励起近赤外光によるトリガーの核移行の観察

1. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD を含む無料の FBS EMEM の 200 μ L でセルのサンプル (の準備ステップ 2.3) を供給 (10 μ M) 37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベートして 3 h の CO₂ 。
2. 培を削除、D pbs 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。EMEM の 200 μ L で細胞サンプルを供給 (10 %fbs)。
3. 共焦点レーザ走査型顕微鏡の細胞サンプルを対象し、励起 488 で顕微鏡写真を記録 nm (λ_obs = 500 530 nm)。
4. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD の核移行の 2 光子励起レーザー興味のセルを含む領域を照射 (710 nm)、2 分間 (30 秒 × 4)、顕微鏡の光源としてインストールされています。4.3 の手順で説明するように、転流を観察します。

5. 紫外線によって引き起こされる高分子のゲストの核移行の観察

1. ^{ボールリテーナ入り}接着剤-ドットを含む無料の FBS EMEM の 200 μ L でセルのサンプル (の準備ステップ 2.3) を供給 (10 nM)、37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベートして 3 h の CO₂ 。
2. 培を削除、D pbs 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。EMEM の 200 μ L で細胞サンプルを供給 (10 %fbs)。
3. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 QD の核移行は、UV ライト 2 分で365 nm バンドパス フィルター搭載 100 W キセノン光源を用いた光ファイバーにセルのサンプルを公開します。紫外線露出なし参照セルのサンプル、暗闇の中でセルのサンプルを保ちます。
4. 核の可視化、培養液にヘキスト 33342 (1 mg/mL) の 1 μ L を追加し、37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベート 10 分の CO₂ 。
5. 共焦点レーザ走査型顕微鏡の細胞サンプルを対象し、405 で励起による顕微鏡写真を記録 nm (λ_obs = 430 520 nm) と 488 nm (λ_obs = 625-680 nm) ヘキスト 33342、量子ドット、それぞれ。

6. セル実行可能性の試金

1. 実装された EMEM のひと肝細胞癌 Hep3B 細胞を維持 (10 %fbs) 37 ° c 未満 5% CO₂。
2. 種細胞実験の前日。実装された EMEM の 96 ウェル培養プレートのウェルあたりの種子 5.0 × 10³ Hep3B 細胞 (10 %fbs、200 μ L)、37 ° c 未満 5% 細胞サンプルをインキュベートと 24 h の CO₂ 。
3. 培を削除、D pbs 100 μ L でセルのサンプルを 2 回すすいでください。
4. ^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD を含む無料の FBS EMEM の 200 μ L で細胞サンプルを供給 (0.1-100 μ M) 37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベートして 3 h の CO₂ 。
5. 365 nm バンドパス フィルター搭載 100 W キセノン光源を用いた光ファイバー経由で2 分紫外線細胞サンプルを公開します。紫外線露出なし類似細胞サンプル、暗闇の中でセルのサンプルを保ちます。
6. 培に携帯はキット 8 カウント試薬 (10 μ L) の 10 μ L を追加し、37 ° C 5% 未満で結果のセルのサンプルをインキュベート 2 h の CO₂ 。
7. 吸収分光法対象セルのサンプル (λ = 450 nm) マイクロ プレート リーダーを使用しています。

結果

、光照射前に^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD と培養 Hep3B 細胞展示、インテリアから点状蛍光性の放出 (λ_ext = 488 nm;図 4 aと4 C、緑)。543 で励起による得られた類似の顕微鏡写真、エンドソームに^{ボールリテーナ入り}接着剤 NBD がローカライズされているを示す赤色蛍光色素 (図 4 b 4 C<...

ディスカッション

タンパク質の光トリガーの転流、細胞の核の前の調査は、ケージ NLS^7,8,9を使用して達成されています。前述したように、これらのメソッドに NLS タグ付きタンパク質の細胞質を組み込む付加的な技術が必要です。対照的に、私たち^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグにより誘起核移行だけでなく、ゲストの細胞内取?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm