Thymidine Analog BrdU를 사용하여 쥐의 세포 증식 및 신경 발생을 분석하는 면역 조직 화학 기술

요약

이 논문은 쥐의 성인 신경 발생을 측정하기 위해 BrdU 양성 세포를 시각화하는 가장 일반적인 4 가지 기술을 제시합니다. 이 작업에는 시약 준비, 티미 딘 유사체 투여, 심경 관류, 조직 준비, 퍼 옥시 다제 면역 조직 화학 반응, 면역 형광, 신호 증폭, 카운터 염색, 현미경 이미징 및 세포 분석에 대한 지침이 포함됩니다.

초록

성인 해마 신경 발생 (AHN) 분야에서 가장 중요한 것 중 하나는 새로 생성 된 세포의 식별입니다. 티미딘 유사체(예: 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU))의 면역검출은 이러한 새로 생성된 세포를 시각화하는 데 사용되는 표준 기술입니다. 따라서 BrdU는 일반적으로 작은 동물에 복강 주사되므로 티미 딘 유사체는 DNA 합성 중에 분열하는 세포에 통합됩니다. 검출은 뇌 절편의 면역 조직 화학 분석에 의해 수행됩니다. 이 기술을 사용해 온 모든 연구 그룹은 성공적인 염색을 달성하기 위해 미세한 세부 사항에 특별한주의가 필요하다는 것을 알 수 있습니다. 예를 들어, 중요한 단계는 HCl을 사용한 DNA 변성으로, 이를 통해 세포핵에 도달하여 염색할 수 있습니다. 그러나 기존의 과학 보고서는 그러한 단계를 자세히 설명하는 것은 거의 없습니다. 따라서 긍정적이고 성공적인 결과를 산출하는 데 몇 개월이 걸릴 수 있으므로 새로운 실험실에서는 기술을 표준화하는 것이 어렵습니다. 이 연구의 목적은 티미 딘 유사체 BrdU로 작업 할 때 면역 염색 기술의 긍정적이고 성공적인 결과를 얻는 단계를 자세히 설명하고 정교화하는 것입니다. 프로토콜에는 시약 준비 및 설정, 설치류에서 티미딘 유사체 투여, 심경 관류, 조직 준비, 퍼옥시다제 면역조직화학 반응, 아비딘-비오틴 복합체 사용, 면역형광, 대조염색, 현미경 이미징 및 세포 분석이 포함됩니다.

서문

평생 동안 성인 인간의 뇌에서 새로운 뉴런이 생성된다는 생각은 수십 년 동안 과학계를 매료 시켰습니다. 뇌가 평생 동안 새로운 뉴런을 생성한다는 지식은 분열 ^1,2에서 세포의 검출을 통해 얻어졌습니다. 성인 뇌에서 새로 생성 된 뉴런의 검출은 쥐에 삼중 티미 딘 (thymidine-H3)을 두개 내 주사하고자가 방사선 촬영 ^1,2로 세포주기에서 세포를 검출함으로써 처음 확인되었습니다. glia의 세포 분열과 신경 모세포의 존재가보고되었으며, 이는 출생 후 신경 발생¹에 대한 최초의 유망한 데이터였습니다. 그럼에도 불구하고 thymidine-H3의 사용 및 검출은 방사능의 사용을 의미했으며, 이는 방사능을 관리하는 사람들에게 해로울 수 있습니다. 신경계에서 세포의 증식, 이동 및 기원 연구에서 BrdU 면역 조직 화학의 적합성을 조사하는 첫 번째 노력은 Miller와 Nowakowski³에 의해 1988 년에 나타났습니다. 1998 년 Eriksson과 동료들이 발표 한 논문에 따르면 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU^{) 4}을 주사 한 환자의 인간 성인 뇌에서 새로운 뉴런이 사후에 시각화되었습니다. 이 환자들은 종양의 성장을 표지하기 위해 BrdU 주사 (250mg 정맥 주사)를 받았다⁴. 이 기술은 동물 모델에 채택되었습니다. 이러한 방법의 도입은 방사성 화합물을 사용하지 않고 새로 생성된 세포를 검출할 수 있었기 때문에 이 분야의 이정표가 되었습니다. 이 절차는 해당 분야의 추가 연구를 촉진하기 위해 성인 뇌 틈새에서 세포 증식을 측정하는 황금 표준이 되었습니다.

티미딘 유사체 기술의 한계는 새로 생성된 세포에 대한 세포 정체성의 결정을 허용하지 않는다는 것이다. 그러나 면역 조직 화학을 통해 동일한 세포의 이중 또는 삼중 표지 기술을 수행 할 수 있으며, 이는 새로 생성 된 세포의 세포 운명과 성숙 단계를 검증하여 분야의 추가 진화로 이어집니다. 이 방법은 새로 생성된 세포를 신경교, 미분화 뉴런 또는 완전히 성숙한 과립 세포로 분화시키고 회로에 적극적으로 참여하고 있는지 확인하는 것까지 특성화되었습니다. 이 분야의 또 다른 돌파구는 네스틴 도메인 하에서 미분화 세포를 식별하기 위해 형질 전환 모델을 사용하는 것이 었습니다. 네스틴-GFP 형질전환 마우스는 강화된 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하며, 이는 네스틴 프로모터의 제어 하에 있습니다. Nestin은 전구 세포⁵를 특징으로하는 중간 필라멘트입니다. 네스틴-GFP 형질전환 마우스는 신경발생에 관여하는 초기 발달 단계를 확립할 수^{있었습니다6.} 그러나 중요한 한계는 실험실 시설에서 특수 조건 하에서 nestin-GFP 형질전환 마우스 콜로니를 유지할 수 있다는 것인데, 이는 일부 과학 그룹, 특히 개발도상국의 그룹에 비용 효율적입니다.

위에서 언급 한 기술에는 장점과 단점이 있습니다. 그러나, 면역조직화학(IHC)에 의한 증식 세포의 동정 및 세포 성숙 단계 또는 세포 운명을 확인하기 위해 면역형광법에 의한 이중 또는 삼중 표지 기술을 수행할 수 있는 가능성은 지금까지 성체 신경발생을 측정하는 가장 실현 가능한 방법을 나타낸다. 면역조직화학을 이용한 동정 과정은 단백질, 단백질 도메인 또는 뉴클레오티드를 1차 항체로 알려진 인식을 허용하는 특정 항체로 표지하는 것으로 구성됩니다. 후자는 2차 항체에 의해 인식되며, 이는 2차 항체와 결합된 발색체 (예를 들어, 양 고추냉이 퍼옥시다제) 또는 플루오로크롬 (예를 들어, FITC)으로 표시된다. 현미경은 크로모겐과 형광 색소 신호를 모두 감지할 수 있습니다. IHC를 사용하여 막 단백질, 세포 골격 단백질 또는 BrdU와 같은 핵 구성 요소를 확인할 수 있습니다. 반면에 BrdU는 경쟁에 의해 S상 동안 DNA에 통합되기 때문에 세포핵에서 찾을 수 있습니다. 따라서 중요한 단계는 HCl을 사용한 DNA 변성으로, 이는 DNA 결합을 열어 BrdU 항체가 DNA 내의 BrdU에 접근할 수 있도록 합니다. BrdU는 복강 내 투여 후 각각 15 분 및 60 분 동안 마우스와 랫트 혈청에서 포화 농도로 존재 한 다음 각각 60 분 및 120 분에 검출 할 수없는 수준으로 급격히 떨어진다는 것을 아는 것이 중요합니다⁷.

여기에서는 DAB (3,3'- 디 아미노 벤지딘) 산 신호 증폭 (4.1 단계)과 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 반응을 사용한 발색 간접 검출 (4.1 단계), 아비딘-비오틴 복합체 (ABC) 증폭 (4.1 단계), 신호 증폭이없는 간접 면역 형광 검출 (4.4 단계) 및 표지 된 스트렙 타비 딘-비오틴 (LSAB) 증폭 (4.3 단계). 각 방법에는 장점과 단점이 있으며 특정 조직 요구 사항에 유용할 수 있습니다( 표 1 참조). 우리는 비접합 1차 항체를 사용할 때 발색성 검출 방법에서 형광 검출 방법으로 변경하기 위해 경제성과 단순성 때문에 간접 ICH 방법을 따르기로 결정했습니다. HRP 접근법은 경제성, 높은 안정성, 높은 회전율 및 기판의 전체 가용성으로 인해 일반적으로 사용되는 IHC 방법입니다. 그럼에도 불구하고 염색 방법이 정확하게 작동하는지 확인하기 위해 양성 대조군을 사용하고 항체 기능을 효과적으로 테스트하기 위해 음성 대조군을 사용하는 것이 좋습니다. 다중 면역염색 또는 다중 IHC 방법(6단계 참조)은 단일 실험에서 조직 절편으로부터 많은 양의 데이터를 획득할 수 있는 강력한 도구이다. 이 기술은 샘플의 가용성이 제한적일 때 특히 중요합니다. 또 다른 장점은 조직 무결성을 유지하면서 동일한 세포 공간에서 공동 발현되는 특정 단백질을 동시에 식별할 수 있다는 것입니다. 멀티플렉스는 특정 증식 단계 (예를 들어, 네스틴, GFAP, DCX, Ki-67) 동안 발현된 상이한 마커를 염색할 수 있게 하여, 보다 상세한 증식 및^{분화 연구8}에 도달할 수 있게 한다. 교차 반응을 피하기 위해 사용되는 고정 기술과 호환되는 항체를 선택하는 것이 중요합니다. 각각의 새로운 항체(BrdU 포함)를 개별적으로 검사하여 방법을 조정하고 개선하는 것이 좋습니다. 그런 다음 이중 순차 염색을 도입하고 마지막으로 순차 방법이 완전히 지배될 때 동시 면역 염색 프로세스를 시작합니다. 이 방법에 적합한 2차 항체를 선택하는 것이 중요합니다.

메서드	구체적인 방법	장점	단점
간접 검출 방법	DAB와의 과산화효소 반응	1. 직접 검출 및 간접 형광 방법보다 감도가 높습니다. 2. 형광 색소보다 광퇴색에 대한 내성이 높습니다. 3. 형광 검출 방법보다 저렴한 비용	1. 더 적은 색 염료로 다중화하기가 어렵습니다. 2. 동일한 세포 공간에서 공동 발현 된 표적에 대해 복잡합니다. 3. 동일한 조직에서 동시에 희소하고 높은 풍부한 표적에 대한 동적 범위 감소.
	형광	1. 더 많은 색깔 염료를 가진 다중화를 위한 제일 그리고 가장 쉬운. 2. 동일한 세포 공간에서 공동 발현된 표적에 가장 적합합니다. 3. 동일한 조직에 동시에 희소하고 높은 풍부한 표적에 대한 더 나은 동적 범위. 4. 추가 단계가 없습니다.	1. DAB 방법을 사용한 간접 과산화 효소 반응보다 민감도가 낮습니다. 2. 시간이 지남에 따라 광퇴색에 대한 약한 저항. 3. 더 비쌉니다.
신호 증폭 방법	아비딘-비오틴 복합체(ABC)	1. 직접 및 간접 검출 방법보다 감도가 높습니다. 2. 배경 줄이기	1. 추가 단계. 2. 증폭하지 않는 것보다 비쌉니다.
	표지 된 스트렙타비딘-비오틴 (LSAB)	1. 직접 및 간접 검출 방법보다 감도가 높습니다. 2. ABC 방법보다 더 실질적인 조직 침투. 3. 배경 줄이기	1. 추가 단계. 2. ABC 방법보다 비쌉니다.
	추가 증폭 방법이 아님	1. 비용 절감. 2. 추가 단계가 없습니다. 3. 높은 풍부한 표적에 이상적입니다.	1. 낮은 감도 : 풍부한 목표가없는 문제.

표 1: IHC 기술의 장점/단점. 이 표는 간접 검출 방법의 장점 / 단점을 보여줍니다 : (3,3'- 디 아미노 벤지딘) DAB 및 형광과의 퍼 옥시 다제 반응; 및 신호 증폭 방법 : 아비딘-비오틴 복합체 (ABC), 표지 된 스트렙 타비 딘 - 비오틴 (LSAB) 및 추가 증폭 방법이 아닙니다.

고해상도 이미지는 적절한 분석을 수행하고 결과를 제시하는 데 필수적입니다. 해상도를 향상시키는 두 가지 접근법이 있습니다 : 1) 더 나은 현미경 디자인 (예 : 공초점, 다광자) 사용 또는 2) 디콘볼 루션⁹을 사용하여 이미지를 향상시키기 위해 흐림 프로세스를 수치 적으로 반전시킵니다. 불행히도, 컨포칼 현미경은 장비 및 서비스 비용이 높기 때문에 저렴하지 않습니다¹⁰. 광시야 에피형광 현미경과 z-스택 이미지의 후속 디콘볼루션은 컨포칼 현미경 ^8,9에 대한 적합하고 저렴한 대안을 제공합니다. 전술한 바와 같이, 디콘볼루션 목표는 수학적 제거 알고리즘(¹⁰)을 사용하여 에피형광 또는 컨포칼 현미경에 의해 얻어진 이미지에 나타난 흐림, 초점이 맞지 않는 헤이즈 및 왜곡을 감소시킴으로써, 획득 시스템(⁹)에 의해 저하되었던 원래의 신호를 복원하는 것이다. 획득 된 흐릿한 이미지는 3D 포인트 스프레드 함수 (PSF)로 관찰 된 물체를 변환 한 결과로 수학적으로 모델링 할 수 있습니다. PSF는 조직 샘플에 의해 방출되고 현미경에 의해 수집 된 빛의 점들의 이론적 회절 패턴이다. PSF 파일은 카메라의 CCD 셀 간격, 사용 된 매체의 굴절률, 대물 렌즈의 개구수, 형광단의 발광 파장, 이미지 크기, z-stack 처리 방법의 이미지 수 및 그 사이의 공간과 같은 각 이미지의 특정 조건으로 생성됩니다 (표 2의 기술 사양 참조). 즉, PSF 파일은 현미경 관찰에 대한 이미징 설정의 효과를 요약합니다⁹. 그러나 회절 PSF 3D 플러그인(https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D)을 사용하여 각 z 스택 이미지에 대한 고유한 PSF 파일을 만듭니다. Z 스택 이미지는 슬라이드의 동일한 XY 위치에서 정의된 깊이(z축)에서 디지털화된 일련의 광학 섹션입니다. 컴퓨터는 다른 초점면에 위치한 물체에서 시작된 신호를 재 할당하여 초점 평면에서 얻은 정보를 컴파일합니다. z-스택 이미지를 생성하려면 슬라이드의 서로 다른 초점 레이어에서 이미지를 가져와야 합니다(예: 1μm 깊이마다 동일한 XY 영역의 서로 다른 이미지 10개). 그런 다음 제조업체 또는 피지에서 제공하는 현미경 소프트웨어를 사용하여 z-stack 또는 3D 이미지를 생성합니다. 결과는 단일 스택 이미지 파일(예: 초점이 다른 10개의 이미지)이 됩니다. 디콘볼루션 현미경을 위한 오픈 소스 소프트웨어와 같은 몇 가지 고객별 도구 및 소프트웨어 솔루션이 있습니다. 피지¹¹ 플러그인 인 DeconvolutionLab2⁹ (ImageJ¹² 배포)를 사용하여 디콘볼루션 프로세스의 출력을 보여줍니다. 디콘볼루션은 최종 현미경 사진의 해상도를 향상시키는 데 도움이 됩니다(그림 1B, C 참조). 자세한 내용과 지침은 참고자료¹³을 읽어 보시기 바랍니다.

그림 1: 여러 색상 채널에 대한 3D 디콘볼루션의 대표 이미지. (A) 저배율에서 DG. (B) 각 채널의 원본 z-스택 이미지와 병합된 이미지. (c) 각 채널 및 병합된 이미지에 대한 3D 디콘볼루션 z-스택 이미지. 이 뇌는 신체 활동 그룹의 일부인 쥐에서 나온 것입니다. 표지된 스트렙타비딘-비오틴(LSAB) 증폭 방법을 사용하였다. BrdU(적색), DAPI를 카운터염색(파란색), 신경교세포섬유산성 단백질(GFAP)을 성상교세포 마커(녹색)로 나타내는 Cy3 스트렙타비딘 접합 항체를 보여주었습니다. ML = 분자층; GCL = 과립 세포층; SGZ = 하위 입상 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 연구의 목적은 면역 염색으로 긍정적이고 성공적인 결과를 얻는 단계에 대한 자세한 설명을 제공하고 컨포칼 현미경을 사용하지 않고 BrdU 기반 연구에서 일반적으로 사용되는 단계를 나열하는 것입니다. BrdU 염색은 성공적인 염색을 위해 주의 깊게 따라야 하는 여러 단계가 필요한 기술입니다. 이러한 염색 기술을 표준화하는 데는 일반적으로 수개월이 걸리며 시간과 자원이 많이 소요됩니다. 우리는 이 기사가 시간과 오류를 줄임으로써 이 분야에서 시작하는 그룹에 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대했습니다.

프로토콜

모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드 (NIH 간행물 N°. 8023, 1978 년 개정) 및 사용되는 동물의 수와 고통을 최소화하기위한 현지 멕시코 법률을 따릅니다. Universidad Iberoamericana의 윤리위원회는이 연구에서 동물을 사용하기위한 실험 프로토콜을 승인했습니다.

1. 시약 준비 및 설정

알림: 대부분의 솔루션은 달리 명시되지 않는 한 사용하기 며칠 전에 준비할 수 있습니다.

1. 브르듀 솔루션
   1. -20°C 냉동고에서 BrdU 용액을 회수하여 실온(RT)에서 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
   2. 쥐의 체중에 따라 50mg/kg의 용량에 필요한 BrdU의 질량을 계산하십시오. 20 mg/mL의 작업 용액에 필요한 0.9% 식염수(멸균 H₂O 100mL에 0.9g NaCl)의 부피를 계산합니다. 주사 당 래트 당 적어도 0.5 mL를 제공하도록 초과분을 준비하십시오.
      참고: 실험 동물에게 투여되는 용량은 안전하고 부작용이 최소화되며 효과적이어야 합니다. 100 mg/kg BrdU를 사용한 염색 기간은 50 mg/^{kg 용량에} 비해 잠재적으로 더 높은 독성을 능가하지 않는 것으로 보고되었습니다7. 쥐⁷에서 50 및 100 mg/kg i.p.에 대한 BrdU 표지 세포/^mm3의 수에서 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. 동물의 고통을 최소화하기 위해 소량을 주사하는 것이 바람직합니다.
   3. BrdU 용액의 무게를 측정하고 원추형 튜브와 와류의 식염수에 첨가하십시오.
      알림: 식염수를 45\u201250 °C의 수조에서 1mL보다 큰 부피로 예열합니다.
   4. 튜브를 50°C의 수조에 10-10-u201215분 동안 놓고 완전히 용해될 때까지 2-20123분마다 와동시킵니다. 멸균 주사를 위해 주사기 필터로 용액을 여과하십시오. 튜브를 주석 호일로 덮고 실온에서 식힌 다음 즉시 사용하십시오.
      주의 : BrdU 용액은 독성이 있으며 잠재적으로 발암 성이 있습니다. 흄 후드에서 준비하십시오. BrdU 용액은 적절한 보호 장비(PPE)로 취급해야 합니다. 사용 직전에 용액을 준비하는 것이 좋습니다. 그러나 용액은 RT 하에서 24 시간 동안 안정적입니다. 빛으로부터 지켜 주세요.
2. pH 7.4에서 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS) 1L를 제조하기 위해, 240mg의 인산칼륨 일염기성(KH2PO4), 1.44g의 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4), 200mg의 염화칼륨(KCl) 및 8g의 염화나트륨(NaCl)을 800mL의 이중 증류수(_ddH2O)에 첨가한다. pH를 7.4로 조정하고 이중 증류된_H2O를 총 부피 1L까지 첨가합니다. 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.
3. 100mL의 PBS+의 경우 0.1M PBS(pH 7.4)에 일반 말 혈청 3%(3mL)와 트리톤 X-100 0.3%(300μL)를 추가합니다. -20°C에서 최대 3개월 동안 20\u201250mL 분취량을 담아 보관하십시오.
   참고: 또는 PBS 대신 TBS를 사용할 수 있습니다. 숙주의 항체 및 실험 조직과 상이한 임의의 다른 혈청이 적합하다.
4. PBS++ 100mL의 경우 일반 말 혈청 10%(10mL)와 트리톤 X-100 0.3%(300μL)를 0.1M PBS pH 7.4에 추가합니다. -20°C에서 최대 3개월 동안 20\u201250mL 분취량을 담아 보관하십시오.
5. 1 L의 동결 방지제 용액에 250 mL의 에틸렌 글리콜과 250 mL의 글리세롤을 혼합하고 혼합 될 때까지 계속 저어줍니다. PBS로 천천히 1L로 가져옵니다. 4등급(20\u201225μm) 여과지로 여과합니다. 4 ° C 또는 RT에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
6. 다음과 같이 0.1 M PBS (PFA 용액)에 4 % 파라 포름 알데히드를 준비하십시오. 용액 1L의 경우 파라포름알데히드 분말 40g을 일정한 교반 하에 60\u201265°C 0.1M PBS 800mL에 천천히 첨가합니다. 파라포름알데히드가 완전히 용해될 때까지 저으면서 온도(60\u201265 °C)를 조절합니다. 필요한 경우 용액을 명확히하기 위해 1M NaOH 몇 방울을 첨가하십시오. 용액이 실온에 도달하면 4 등급 (20-25 μm) 여과지로 여과하십시오.
   주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이 있으며 발암 물질로 의심되므로 흄 후드에 준비하십시오. 4°C에서 보관하고, 바람직하게는 2일 이내에 사용하는 것이 좋다. PFA 즉시 사용 가능한 솔루션은 상업적으로 이용 가능합니다.
7. pH 6에서 10mM 시트르산나트륨 완충액(SCB) 1L에 대해, 일정한 교반하에 800mL의 이중 증류된_H2O에 1.204g의 시트르산나트륨(이수화물) 및 1.134g의 시트르산을 첨가한다. pH를 6.0으로 조정하고 ddH₂O를 최대 1L까지 첨가하십시오. 4 ° C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
8. 일정한 교반하에 41.75mL의 ddH2O에 8.25mL의_12NHCl(농축 원액)을 천천히 첨가하여 2N HCl 50mL를 준비합니다.
   주의 : 흄 후드에서 준비하십시오. 용액은 사용 직전에 준비해야합니다.
   참고: 2 N HCl은 중요한 단계인 DNA 변성에 사용됩니다. BrdU가 DNA에 통합됨에 따라 HCl은 BrdU 항체가 DNA 내에서 BrdU에 접근할 수 있도록 하는 DNA 결합을 여는 데 사용됩니다.
9. 다음과 같이 내인성 과산화효소 차단 용액을 준비한다. 일정한 교반하에 2mL의 30% 과산화수소와 98mL의_ddH2O를 혼합하여 0.6% 과산화수소 100mL를 준비합니다.
   알림: 용액은 사용 직전에 준비해야합니다. H2O2는 빛에민감하므로 어둠 속에 보관하십시오. 물 대신 PBS 또는 TBS를 사용할 수 있습니다.
10. 제조업체의 지침에 따라 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 용액을 준비하십시오. 0.1M PBS에 ABC 5mL에 시약 A 2방울(≈100μL)을 넣고 혼합한 다음 시약 B 2방울(≈100μL)을 넣고 혼합합니다.
    알림: 용액을 준비하고 사용하기 전에 20-201230분 동안 텀블러 롤링해야 합니다.
11. 제조업체의 지침에 따라 키트를 사용하여 DAB(디아미노벤지딘) 과산화효소(HRP) 기질을 준비합니다. _ddH2O5mL에 시약 1 2방울(≈ 84μL)을 넣고 혼합하고, 시약 2 4방울(≈ 100μL)을 넣고 혼합한 후 시약 3 2방울(≈ 80μL)을 넣고 혼합합니다. 마지막으로 원하는 경우 시약 4(니켈) 2방울(≈ 80μL)을 넣고 혼합합니다.
    알림: 용액은 사용 직전에 준비해야 합니다.
    주의 : DAB는 독성이 있으며 잠재적으로 발암 성입니다. 각 기관의 유해 폐기물 규정에 따라 주의해서 처리하고 폐기해야 합니다. DAB를 비활성화하려면 표백제 (차아 염소산 나트륨) 몇 방울을 추가하십시오. 솔루션이 검게 변합니다.
12. 55\u201260°C에서_ddH2O80mL에 크레실 바이올렛 아세테이트 100mg과 아세트산 250μL를 첨가하여 크레실 바이올렛 용액 100mL를 준비합니다. 부피를 100mL로 조정하고, 여과하고, 어두운 색의 용기에 4°C에서 보관한다.
    알림: 사용자는 귀중한 조직 샘플에 사용하기 전에 다양한 농도의 크레실 바이올렛 용액을 테스트하는 것이 좋습니다. 결과는 일부 조직 샘플로 대조 염색할 때 더 어두울 수 있으며, 이는 BrdU 양성 세포를 정확하게 계수하는 능력을 감소시킬 수 있습니다.

2. 티미딘 유사체 BrdU 투여

1. 실험 동물(예를 들어, 90일된 수컷 체중 350 g의 Wistar 랫트)을 하복부에 고정화시켜 제지한다.
2. 23G 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 BrdU 용액(50mg/kg)을 복강내(즉p) 투여합니다.
   알림: 동물의 무게에 따라 주입량을 조정하십시오. 성인 쥐의 경우 23-201227G 바늘과 1-mL 주사기를 사용하십시오. 성인 쥐의 최대 허용 복강 내 주사량은 10mL입니다. 다른 경로를 사용하여 BrdU 솔루션⁽¹⁴)을 관리할 수 있습니다. 예를 들어, 복강 주사 또는 음용수를 통한 경구 투여.

3. 조직 준비

참고: 3개월 된 쥐는 7일 동안 신체 활동(무한 바퀴)에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 6일째에, 랫트에게 BrdU(단계 2)를 12시간 간격으로 3회 주사하였다. 마지막 BrdU 주입 후 3시간 후에 섹션 8의 단계를 수행합니다.

1. 펜토 바르비탈 (50 mg / kg i.p.)을 주사하고 동물이 깊게 마취 될 때까지 몇 분 정도 기다리십시오.
   알림: 계속하기 전에 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 다리 또는 꼬리 중 하나를 조심스럽게 꼬집습니다. 동물이 자극에 반응하면 몇 분 더 기다리십시오. 동물이 핀치에 반응하지 않으면 다음 단계로 이동하십시오.
2. 흉골 아래의 복강 피부를 절단하고 갈비뼈를 분리하고 횡격막을 절단하여 심장을 노출시킵니다.
3. 심근 관류 고정
   1. 좌심실에 바늘을 삽입하고 우심방에 작은 절개를하십시오. 펌프 또는 중력을 사용하여 전체 혈액이 배출되고 용액이 투명해질 때까지 관류 (유속 5-mL / 분) 0.1M PBS를 관류합니다.
   2. 펌프 또는 중력을 사용하여 PFA 용액으로 저온 관류 (유속 5-u20127mL / min)를 수행하여 꼬리가 단단해질 때까지 조직을 고정합니다.
      참고: 일반적으로 300g의 쥐에는 약 100\u2012150mL의 PFA 용액이 필요합니다. 조직 고정은 선택 사항입니다. 이에 의해, 실험에서 동물 사용을 최소화하기 위해 다양한 공정에서 사용하기 위해 뇌를 추출할 수 있다.
4. 해부 및 사후 고정
   1. 동물의 목을 베고 두개골에서 뇌를 부드럽게 추출하십시오. 뇌를 PFA 용액(250mg 쥐의 경우 ~40mL)이 들어 있는 원추형 튜브에 4°C에서 1-1일 동안 담그십시오.
      참고: 항원을 사용할 수 없기 때문에 조직 염색이 고갈될 수 있으므로 과도하게 고정하지 마십시오(48시간 이상).
   2. 일정한 교반 하에 0.1M PBS 용액 70mL에 30g의 수크로오스를 첨가하고, 30mL의 30% 슈크로스 용액 100mL를 준비한다. 0.1 M PBS 용액을 100 mL에 첨가한다. 뇌가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 약 1-1일 동안 30% 자당 용액(35mL)이 포함된 원뿔형 튜브에 뇌를 담그십시오.
5. 관상 동맥 뇌 절편 절단
   알림: 저온 유지 장치 마이크로톰을 사용하려면 지침과 교육이 필요합니다. 자세한 지침은 참고자료¹⁵를 참조하십시오.
   1. 뇌 전체를 -80 ° C의 이소 펜탄에 담그고 -80 ° C에서 10 분 동안 유지하십시오. 뇌를 저온 유지 장치-마이크로톰 플레이트의 임베딩 매트릭스에 놓습니다.
      알림: 특정 조건에서 -80 ° C에서 뇌를 급속 동결하면 조직이 골절되거나 손상 될 수 있습니다. 사용자는 이 문제를 알고 있어야 합니다. 이 경우 -20 ° C 이소 펜탄을 사용하여 뇌를 동결하십시오.
   2. 저온 유지 장치를 사용하여 마이크로톰(-25 내지 -20°C의 온도)을 사용하여 40 μm 두께의 관상 절편을 절단하였다. 그림 2의 가이드에 따라 냉동 보호 용액이 있는 24웰 세포 배양 플레이트로 섹션을 순차적으로 옮깁니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 최대 몇 개월 동안 보관하십시오.
      알림: 그런 다음 메쉬 인서트가 있는 12웰 플레이트에서 40μm의 자유 부동 직렬 섹션의 모든 조직을 부드럽고 지속적인 교반(10rpm)으로 처리합니다. 적절한 조건에서 수년간 뇌 섹션을 저장할 수 있습니다.

그림 2: 저온 유지 장치 마이크로톰에서 냉동 보호 용액이 있는 24웰 세포 배양 플레이트로 섹션을 순차적으로 옮기는 개략도. A1 웰에서 시작하여 다음 슬라이스를 행 A에 배치합니다. A6 우물 후 다음 행 B로 이동합니다. D6에 도착하면 A1로 돌아가서 계속하십시오. 이러한 배열은 전체 뇌 영역의 N번째 (예를 들어, 신경발생의 경우 6번째, 하나의 컬럼의 내용에 해당) 섹션 정량화를 허용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 면역염색

참고: 각 기술의 장점과 단점에 대한 요약은 표 1 을 참조하십시오.

1. DAB와의 과산화효소 반응을 이용한 BrdU 검출
   참고: 1일째에 4.1.1-4.1.5단계를 수행합니다.
   1. 냉동 보호 용액에서 슬라이스를 실온에서 0.1M PBS로 옮깁니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   2. 내인성 과산화효소 차단 용액에서 30분 동안 배양하여 내인성 과산화효소를 비활성화합니다. 0.1M PBS로 각각 10분씩 3회 헹굽니다. 임의로, 항원 검색을 수행한다(섹션 5 참조). 슬라이스를 37°C에서 2 N HCl로 20분 동안 인큐베이션한다. 0.1M 붕산염 완충액(8.5pH)에서 10분 동안 헹굽니다. 얼음처럼 차가운 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   3. 슬라이스를 PBS++(블로킹 용액)로 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 항-BrdU 1차 항체(마우스 숙주)와 함께 PBS+에서 1:250 농도로 4°C에서 밤새 배양합니다.
   4. 2일째에 슬라이스를 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   5. 실온에서 2시간 동안 PBS+에서 1:250 HRP 접합 2차 항체(항-마우스)와 함께 배양합니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   6. 슬라이스를 DAB 과산화효소(HRP) 기질 용액으로 옮기고 2-201210분 동안 배양합니다. 슬라이스가 짙은 회색이 되면 돋보기나 현미경으로 조직을 시각화합니다. 양성 세포가있는 경우 수돗물로 3 회 (각각 15 분 동안) 헹굽니다 (배경을 줄이기 위해). 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 세척합니다.
   7. 부드러운 브러시를 사용하여 젤라틴 슬라이드에 슬라이스를 조심스럽게 장착하고 실온에서 밤새 자연 건조시킵니다. 얼룩을 방지하고(섹션 7.1 참조) 영구 장착 매체를 추가하고 커버슬립을 놓습니다. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
2. 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체와의 퍼옥시다제 반응을 이용한 BrdU 검출
   참고: 1일째에 4.2.1-4.2.5단계를 수행합니다.
   1. 냉동 보호 용액에서 슬라이스를 0.1M PBS로 옮겨 실온으로 가져옵니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   2. 내인성 과산화효소 차단 용액과 함께 30분 동안 배양하여 내인성 과산화효소를 비활성화합니다. 0.1 M PBS에서 각각 10분 동안 3회 헹굽니다. 임의로, 항원 검색을 수행한다(섹션 5 참조).
   3. 37°C에서 2 N HCl로 20분 동안 배양한다. 0.1M 붕산염 완충액(pH 8.5)에서 10분 동안 헹굽니다. 얼음처럼 차가운 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 세척합니다.
   4. PBS++(블로킹 용액)에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
   5. 항-BrdU 1차 항체(마우스 숙주)와 함께 PBS+에서 1:250으로 4°C에서 밤새 배양합니다.
   6. 2일째에 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   7. PBS+에서 1:250 비오틴화된 2차 항체(항-마우스)와 함께 실온에서 2-2시간 동안 배양합니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   8. ABC 용액에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   9. 슬라이스를 DAB 퍼 옥시 다제 (HRP) 기질 용액으로 옮기고 2-201210 분 동안 배양합니다. 슬라이스가 짙은 회색이 되면 돋보기나 현미경으로 조직을 시각화합니다. 양성 세포가 있는 경우 수돗물(배경 감소)로 3회(각 15분) 헹구고 0.1M PBS로 3회 10분 동안 헹굽니다.
      알림: 용액은 사용 직전에 준비해야 합니다. 조직의 불규칙한 어두운 반점으로 인해 뇌 조각이 서로 달라 붙지 않도록주의해야합니다.
   10. 부드러운 브러시를 사용하여 젤라틴 슬라이드에 슬라이스를 조심스럽게 장착 한 다음 실온에서 밤새 자연 건조시킵니다.
   11. 필요한 경우 얼룩을 방지하고(7.1단계 참조) 영구 장착 매체를 추가하고 커버슬립을 놓습니다. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
3. 표지된 스트렙타비딘-비오틴(LSAB) 증폭을 사용한 면역형광법에 의한 BrdU 검출
   참고: 1일째에 4.3.1 - 4.3.4단계를 수행하십시오.
   1. 냉동 보호 용액에서 슬라이스를 실온에서 0.1M PBS로 옮깁니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다. 임의로, 항원 검색을 수행한다(섹션 5 참조).
   2. 37°C에서 2 N HCl 중에서 20분 동안 배양한다. 0.1M 붕산염 완충액(8.5pH)에서 10분 동안 헹굽니다. 얼음처럼 차가운 0.1M PBS에서 각각 10분 동안 3번 헹굽니다.
   3. PBS++(블로킹 용액)에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다. PBS+에서 1:250 항-BrdU 1차 항체(마우스 숙주)와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.
   4. 2일째에 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   5. PBS+에서 1:250 비오틴화된 2차 항체(항-마우스)와 함께 실온에서 2-2시간 동안 배양합니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다. 실온에서 1:250 형광 색소 접합 스트렙타비딘(Cy3)과 함께 PBS(혈청을 사용하지 않음)에서 1\u20122시간 동안 배양합니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
      알림: 세럼은 비오틴을 함유할 수 있으며 희석제에 첨가해서는 안 됩니다. 대신 트리톤 X-100의 0.3 %를 함유 한 PBS를 사용하십시오.
   6. 부드러운 브러시를 사용하여 젤라틴 슬라이드에 슬라이스를 조심스럽게 장착하거나, 실온에서 밤새 자연 건조하거나, 적절한 장착 매체를 사용하여 즉시 장착하십시오. 얼룩을 방지하고(7.2단계 참조) 영구 장착 매체를 추가하고 커버슬립을 놓습니다. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
4. 간접 면역형광법에 의한 BrdU 검출
   참고: 1일째에 4.4.1 - 4.4.4단계를 수행합니다.
   1. 실온에 도달할 때까지 냉동 보호 용액에서 0.1M PBS로 슬라이스를 옮깁니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다. 필요한 경우 항원 검색을 수행합니다(선택 사항, 섹션 5 참조).
   2. 37°C에서 2 N HCl 중에서 20분 동안 배양한다. 0.1M 붕산염 완충액(8.5pH)에서 10분 동안 헹굽니다. 얼음처럼 차가운 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다. PBS++(블로킹 용액)로 실온에서 2시간 동안 배양합니다. PBS+에서 1:250 항-BrdU 1차 항체(마우스 숙주)와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.
   3. 2일째에 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   4. PBS+에서 1:250 형광 색소 접합 2차 항체(항-마우스)와 함께 실온에서 2\u20124시간 동안 배양합니다. 0.1M PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
   5. 부드러운 브러시를 사용하여 젤라틴 슬라이드에 슬라이스를 조심스럽게 장착하거나, 실온에서 밤새 자연 건조하거나, 적절한 장착 매체를 사용하여 즉시 장착하십시오. 얼룩을 방지하고(7.2단계 참조) 영구 장착 매체를 추가하고 커버슬립을 놓습니다. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.

5. 항원 검색 (선택 사항)

참고: 항원 검색은 많은 항원의 3차 및 4차 구조를 수정하여 항체로 검출할 수 없도록 하는 고정으로 인한 항원성 손실을 교정하기 위한 선택적 단계입니다. 이 단계는 원래 프로토콜에 추가할 수 있습니다.

1. 전자 레인지 또는 수조에서 10mM 구연산 나트륨 완충액 (SCB) pH 6 용액을 90\u201295 ° C로 예열합니다 (고도에 따라 용액이이 온도 주변에서 끓기 시작함). 50mL 코니컬 튜브(40mL)의 80%를 예열된 SCB로 채웁니다. 슬라이스를 SCB를 사용하여 원뿔형 튜브에 메쉬 삽입물로 전송합니다. 18-18-1220G 바늘로 만든 구멍이 있는 나사 캡으로 튜브를 덮습니다.
2. 슬라이스를 80\u201285°C의 SCB에서 최소 전력 수준으로 전자레인지에서 교대로 온난화 주기로 30분 동안 유지합니다. 필요한 경우 원추형 튜브를 SCB로 다시 채우십시오. 메쉬 인서트와 함께 즉시 슬라이스를 얼음처럼 차가운 0.1M PBS로 옮기고 각각 10분 동안 3번 헹굽니다.

6. 다중 면역 염색 (선택 사항)

참고: 이 단계의 근거에 대해서는 소개 섹션을 참조하십시오.

1. 동시 다중 면역염색
   1. PBS+에서 표적에 대한 1차 항체 (예를 들어, 마우스 항-BrdU, 및 토끼 항-GFAP)를 갖는 칵테일을 준비한다. 사용되는 각 1차 항체에 대해 다른 숙주를 사용하십시오. 4°C에서 밤새 배양한다. 각 프로토콜에 대해 동일한 다음 단계를 계속합니다.
   2. 사용된 각각의 1차 항체(예를 들어, 염소 항-마우스 FITC, 염소 항-토끼 TRITC)에 대한 상응하는 2차 항체를 각각의 프로토콜에 대해 동일한 희석제 용액으로 칵테일을 제조한다. 각 프로토콜에 대해 동일한 다음 단계를 계속합니다. 이상적으로는 교차 반응을 피하기 위해 동일한 숙주에서 나오는 2차 항체를 사용하십시오.
2. 순차적 인 다중 면역 염색.
   1. 제1 항체 표적 (예를 들어, 마우스 항-BrdU)에 대한 프로토콜을 따르고 슬라이스를 장착하기 전에 중지한다. PBS++(블로킹 용액)로 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
   2. 두 번째 1차 항체 (예를 들어, 토끼 항-GFAP)를 PBS+에서 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 제2 2차 항체 (예를 들어, 염소 항-토끼 TRITC)의 배양을 포함하는 각각의 프로토콜에 대한 다음 단계를 따른다. 각 프로토콜에 대한 다음 단계를 끝까지 계속합니다.

7. 카운터 염색 (옵션)

1. 퍼옥시다제 반응을 사용하는 프로토콜의 경우, 크레실 바이올렛 용액을 60°C로 예열한다. ddH₂O로 슬라이드를 1 분 동안 수화시킵니다. 슬라이드를 뜨거운 크레실 바이올렛 용액에 5-5-201220분 동안 배양합니다.
   1. 슬라이드를 ddH₂O로 1 분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 70%, 80%, 90% 및 100% 에틸 알코올로 각각 1-1분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 크실렌으로 1-1-20123분 동안 헹굽니다.
   2. 영구 소수성 장착 매체를 추가하고 커버 슬립을 배치합니다.
      알림: 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. PVA(폴리비닐알코올)-DABCO를 포함하는 자체 제작 장착 매체를 사용할 수 있습니다.
2. 면역형광법을 사용하는 프로토콜의 경우 DAPI, 요오드화프로피듐 또는 이와 유사한 소량의 친수성 장착 배지(25\u201250μL)를 추가합니다. 매니큐어 또는 플라스틱 밀봉 제로 주변을 밀봉하십시오. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.

8. 이미징 및 분석

참고: 현미경 설정 사양은 표 2 를 참조하십시오. 일반적으로 염색된 새 세포를 계수하는 것은 퍼옥시다제 반응 염색된 슬라이스(더 저렴한 방법)를 사용하여 수행되지만 면역형광을 사용하여 수행할 수도 있습니다.

1. 세포를 정량화하려면 먼저 4x 배율 렌즈로 치아 이랑을 적절하게 식별하십시오 (DG 해부학 적 세부 사항에 대한 자세한 지침은 Amaral et ^al.16 참조).
   1. 치아 이랑의 과립 세포층에서 BrdU로 표지 된 핵을 검색합니다 (40x 배율 렌즈 사용). 새 셀이 다른 레이어에 분포될 수 있으므로 z축을 따라 철저히 셀 검색을 수행합니다( 비디오 1 참조).
   2. 치아 이랑 전체에서 세포를 검색하기 위한 간격 섹션을 선택합니다(예: 조직의 6번째 섹션마다, 240μm마다 해당).
   3. 모든 BrdU 양성 세포를 세십시오. 표지 된 핵의 형태는 세포가 얼마나 많은 BrdU를 통합했는지에 따라 변할 수 있습니다 (가이드로 그림 3 참조). z축 위로 천천히 이동하여 클러스터를 통합하는 여러 핵을 모두 정량화합니다( 비디오 2 참조).
   4. 계수된 셀의 총 수에 선택된 간격 섹션(예: 6)을 곱하여 BrdU 표지된 새 셀의 총 수를 추정합니다.
   5. 이상적으로는 정기적 인 실험에서 동물 당 최소 10 개의 섹션과 그룹 당 최소 5 개의 동물을 세십시오.
2. 이미지 디콘볼루션(선택 사항)
   참고: 이 단계에 대한 중요한 정보는 소개 섹션을 참조하십시오. 이 절차에는 단색 이미지 (회색조)가 필요합니다. 컬러 이미지를 회색조로 변환합니다. 이미지가 RGB 합성인 경우 먼저 채널을 분할하고 단일 이미지(합성 아님)로 병합한 다음 8비트 회색 음영으로 변환합니다.
   1. 현미경 사진에서 z 스택 파일을 만듭니다.
   2. 플러그인 옵션 메뉴에서 회절 PSF 3D 플러그인(https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D)을 열어 점 확산 함수(PSF) 파일을 만듭니다. 필요한 모든 데이터를 입력합니다(표 2 참조). 확인을 누르고 파일을 저장합니다.
   3. 옵션 플러그인 메뉴에서 DeconvolutionLab2⁹ 플러그인을 엽니다(http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/). 일치하는 z 스택 이미지와 PDF 파일을 해당 창 슬롯으로 드래그합니다.
   4. 디콘볼루션 알고리즘(예: Richardson-Lucy)과 반복 횟수(예: 20)를 선택합니다. 실행을 누릅니다.
   5. 디컨볼루션된 이미지를 단일 z 스택 이미지로 결합하여 상단의 이미지 메뉴에서 스택을 선택합니다. 그런 다음 Z 프로젝트를 클릭합니다. 투영 유형 드롭다운 메뉴에서 최대 강도를 선택하고 OK를 누른 다음 파일을 저장합니다.
   6. 위의 단계에서 만든 단일 z-stack 이미지 파일을 사용하여 RGB 이미지를 만들고 상단의 이미지 메뉴에서 색상을 선택하여 원하는 의사 색상을 사용합니다. 그런 다음 채널 병합을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 해당 이미지를 원하는 색상 채널로 설정합니다. 합성 만들기 상자의 선택을 취소하고 OK를 누른 다음 파일을 저장합니다(그림 4 참조).
   7. 채널 이미지가 두 개 이상 있는 경우 8.2.1\u20128.2.5단계를 반복합니다. 8.2.6단계에 따라 두 개 이상의 이미지 파일을 열고 각 이미지 파일에 대해 서로 다른 색상 채널을 선택하여 RGB 이미지 파일을 만듭니다( 그림 4 참조).

결과

위에서 설명한 방법은 추가 신체 활동이없는 대조군과 달리 자발적인 신체 활동 후 성인 쥐 해마에서 신생아 세포를 정량화하는 데 적용되었습니다. 우리는 출생 후 쥐 해마를 양성 대조군으로 사용했습니다. 생후 3개월령의 수컷 랫트는 7일 동안 자발적인 신체 활동 프로토콜(endless wheel) 하에 있었다. 6일째에, 래트에게 BrdU를 주사하였고 (섹션 2), 3회 완전 주사까지 매 12시간마다 주사하였다. 3개의 세포 주기 분열을 완료하기 위해, 동물을 마지막 BrdU 주사 8시간 후에 경심 관류 (섹션 3)하였다. 비교 대조군으로 사용하기 위해 신체 활동을하지 않은 3 개월 된 쥐에게도 동일한 절차가 사용되었습니다. 양성 대조군으로서, 생후 1일령 래트 새끼(출생 후 1일)에 상기 섹션 2에 기재된 바와 같이 BrdU를 1회 주사하였다. 주사 후 1 일 (출생 후 2 일째), 새끼를 안락사시키고, 그들의 머리를 단계 3.4에 설명 된대로 PFA 용액에 침지시켰다. 성인 래트를 심부 마취시키고(단계 3.1), 단계 3.2에 기재된 바와 같이 경심 관류시켰다. 뇌를 해부하고 사후 고정시켰다 (3.4 단계). 뇌를 40 μm 관상 절편으로 절단하였다(단계 3.5). 절편을 단계 4에 기재된 바와 같이 BrdU 면역조직화학에 대해 처리하였다.

염색(단계 4.1) 및 DG에서 BrdU 양성 세포 계수를 위해 DAB IHC와 함께 양 고추냉이 과산화효소 반응을 사용했습니다. 도 5 는 BrdU 표지된 세포를 갖는 DG 섹션을 나타낸다. 도 5C, D 는 고배율에서 DG 단면의 대표적인 부분을 나타낸다. 표지 된 세포는 화살표로 표시된 강렬한 어두운 염색을 보였다. 삽입물은 실험군 및 대조군에서 표지된 세포의 평균 수를 나타낸다(계수된 양성 세포에 6을 곱한 값은 단계 8.1에 기재된 바와 같이). 스튜던트의 t-검정은 BrdU 양성 세포 수 간에 유의한 차이를 나타냈습니다(t₍₁₀₎ = 2.704, p = 0.0222). 신체 활동을하지 않은 대조군은 2,040 ± 314 세포 (n = 6 랫트)를 보였다. 이에 비해 신체 활동 그룹은 평균 3,606 ± 486 (n = 6 랫트) BrdU 양성 세포를 보였다. 관찰 된 바와 같이, 신체 활동 노출은 BrdU 양성 세포를 증가시킵니다. 따라서, 이들 결과는 신체 활동이 성인 치아 이랑¹⁷에서 세포 증식을 증가시킨다는 것을 보여주는 다른 보고된 결과와 일치한다.

그림 3: BrdU 표지된 세포핵의 다양한 형태의 예. BrdU는 핵을 표지하는 DNA 합성 마커입니다. 해마 영역에서, BrdU 양성 핵은 치아 이랑 하위 과립 영역에 위치한 반 타원형 모양을 가졌다. BrdU는 경쟁에 의해 통합되기 때문에 모든 세포에 대해 통합된 양은 나중에 핵이 시각화되는 방식에 반영될 변형을 갖게 됩니다. (A) 면역형광 이미지. (B) 추가적인 증폭 방법 없이 과산화효소 반응을 이용한 이미지를 제시한다. 노란색 화살표는 아티팩트 및 비특이적 신호를 나타냅니다. 검은색 또는 흰색 화살표는 BrdU+ 셀을 나타냅니다. 1 – 완전히 정리된 핵, 반타원형 핵 고도로 착색됨. 2 – 점이 있는 핵, 핵의 경계가 표시되고 내부에 여러 점이 있습니다. 3 – 점이 거의 없는 핵, 핵의 경계가 표시되고 내부에 적은 수의 점이 있습니다. 4 – 작은 핵은 다른 분화 단계에서 가능한 세포이지만 여전히 틈새의 일부입니다. 5 – 클러스터는 분열중인 전구체 세포이므로 응축 된 그룹으로 함께 여러 세포를 관찰 할 수 있습니다. 이러한 그룹 내에서 양성 세포의 잘못된 라벨링을 피하기 위해 특히 신중하게 계산해야 합니다. 빨간색 화살표는 단일 세포로 혼동될 수 있는 분열 중인 핵을 나타냅니다. 각 셀은 상자에 포함되어 있으며 Z 축 평면에서 실시간으로 구별 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 단일 및 병합 채널의 대표적인 RGB 이미지. 위쪽 이미지는 원본 z-스택 이미지를 나타내고 아래쪽 이미지는 3D 디콘볼루션된 z-스택 이미지를 보여줍니다. (A) DG의 저배율. (B) 각 채널에 대한 RGB 영상, (C) RGB 병합 영상. 이것은 대조군의 뇌였습니다. 면역형광법은 추가적인 증폭 방법 없이 사용하였다. BrdU (빨간색), 대조 염색 (파란색)으로서의 DAPI, 성상 교세포 마커 (녹색)로서의 GFAP (신경교 섬유 산성 단백질). ML = 분자층; GCL = 과립 세포층; SGZ = 하위 입상 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 각 실험군에 대한 BrdU 표지된 세포(강렬한 다크)를 갖는 대표적인 DG 절편. 퍼옥시다제 반응은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체 증폭법과 함께 사용하였다. (ᄀ, ᄂ) DG의 낮은 배율을 표시하고, (C, D)는 더 높은 배율에서 상자 영역을 표시합니다. 패널 A 및 C는 신체 활동 그룹으로부터의 조직이고, 패널 B 및 D는 대조군으로부터의 조직이다. 삽입물은 신체 활동 및 대조군에서 표지된 세포의 평균 수를 나타낸다(계수된 양성 세포에 단계 8.1에 기재된 바와 같이 6을 곱함). ML = 분자층; GCL = 과립 세포층; SGZ = 아입계 영역; 화살표는 BrdU+ 셀을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1 : 다른 층에 분포 된 z 축을 따라 양성 세포의 다른 초점을 보여주는 비디오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 2: 서로 다른 층에 분포된 z축을 따라 양성 세포 클러스터의 다른 초점을 보여주는 영상. z축 위로 천천히 이동하여 클러스터를 통합하는 여러 핵을 모두 정량화합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

현미경 유형:	에피형광 현미경 올림푸스 BX53
광원:	고압 130W 수은 아크 램프 (U-HGLGPS)
수집 소프트웨어:	셀센스 스탠다드
필터 세트:	카탈로그 번호		여기 범위	이색 거울	억제 범위
	유푸		340 - 490 나노미터	410 나노미터	420 나노미터
	U-FBW		460 - 495 나노미터	505 나노미터	510 나노미터
	U-FGW		530 - 550 나노미터	570 나노미터	575 나노미터
사진기:	모델:		CCD 카메라 UC50
	스펙트럼 범위:		290 – 1000 nm
	CCD 칩 크기:		2/3인치, 2588(너비 *7) X 1960(높이 *8) 픽셀
	픽셀 크기:		3.4 X 3.4 마이크로미터
형광 색소:	이름		여기 파장 (nm)	발광 *3 파장(nm)	방출 색상
	4, 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 - 인돌 HCI (DAPI)		345	455	파랑
	테트라메틸로다민-이소티오시아네이트(TRITC)		541	572	빨강
	플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC)		494	519	녹색
	싸이3		552	565	빨강
장착 매체 및 침지 오일:	이름			미디어의 굴절률 *1
	공기(슬라이드와 렌즈 사이에 아무것도 없음)			1.00029
	DAPI가 있는 페이드 방지 장착 매체			1.45
	퍼마운트 마운팅 미디엄			1.519
	저자가 형광 침지 오일 (MOIL-30 유형 F)			1.518
확대 렌즈(플랜 형석)	확대	개구수 (NA) *2	분해능 (μm)	이미지 픽셀 간격(nm) *5	슬라이스 간격 Z축(nm) *6
	4배	0.13	2.12	850	3000
	10배	0.3	0.92	340	3000
	20배	0.5	0.55	170	2000
	40배	0.75	0.37	85	1000
	100배	1.3	0.21	34	1000

표 2: 현미경 설정 사양 및 점 확산 기능(PSF) 파일 생성 요구 사항. 회절 PSF 3D 플러그인 창에는 PSF 파일을 만들 수있는 11 개의 슬롯이 있습니다. 각 슬롯의 설명은 다음과 같습니다: *1 - 매체 굴절률: 슬라이드와 렌즈 사이의 매체 굴절률(예: 공기 = 1.00029). *2 - 개구수 수치: 사용된 렌즈의 NA(다른 침지 미디어를 사용하고 렌즈를 할당한 경우 수정해야 함). *3 - 파장: 형광 색소 최대 발광 파장(nm). *4 - 종방향 구면 수차: 0.00. *5 - 이미지 픽셀 간격: CCD 픽셀 크기(nm)/배율(예: 3.4μm 및 100X 렌즈, 3400/100 = 34nm). *6 - 이미지 Z축 사이의 거리. *7 - 폭: 디컨벌루션할 이미지의 폭을 픽셀 단위로 입력합니다. *8 - 높이: 디컨볼루션할 이미지의 높이를 픽셀 단위로 입력합니다. *9 - 깊이, 슬라이스: z-스택의 이미지 수입니다. *10 - 정규화: 픽셀 값의 합 = 1. *11 - 제목: PSF 파일의 원하는 이름입니다. 파일은 지정된 고유한 z 스택 이미지와 일치해야 합니다.

토론

성인 신경 발생은 평생 동안 새로운 뉴런을 생성 할 가능성이있는 성인 신경 전구체 세포의 틈새에서 가장 자주 발생하는 과정입니다. 브로모데옥시우리딘(BrdU) 표지는 성인 뇌에서 새로 생성된 세포의 수를 특성화하기 위해 면역학에서 널리 사용됩니다. BrdU는 주로 별개의 뇌 영역 (신경 인성 영역)의 세포에 통합됩니다. 이 세포는 해마의 치아 이랑인 뇌실 하 영역(SVZ)에 위치하며, 이는 아과립 영역(SGZ)으로 알려진 힐루스와 과립 세포 사이에 있습니다.^1,2,18. 또한, 시상 하부, 선조체, 신피질 및 편도체¹⁹를 포함하여 성인기에 더 낮은 증식 능력을 특징으로하는 다양한 뇌 영역이 있습니다. 앞서 언급했듯이 BrdU 염색은 세포 증식을 감지하기 위해 성인 신경 발생 연구에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 BrdU를 마커로 사용하는 데는 한계와 함정이 있습니다. 첫 번째는 BrdU가 세포주기 마커라는 것입니다. 따라서 세포 운명을 확인하고 표지 된 세포의 특정 발달 단계를 검출하기위한 세포 마커를 포함하기 위해 이중 또는 삼중 염색을 수행해야합니다. BrdU에 대한 또 하나의 우려는 DNA 안정성을 수정하는 독성 및 돌연변이 유발 용액이 세포 기능과 세포주기를 변화시킬 수 있다는 것입니다. 투여 프로토콜 및 투여 용량(50\u2012600 mg/kg)을 따르기로 결정할 때 이전 정보를 고려해야 합니다. 또 다른 중요한 특징은 BrdU가 세포 증식 마커¹⁴가 아니라 DNA 합성 마커라는 것이다. 따라서 세포 증식을 DNA 복구, 중단된 세포 주기 재진입 및 유전자 복제와 같은 다른 사건과 구별하는 것이 적절합니다. 연구원은 BrdU의 적절한 사용을 보장하기 위해 적절한 통제를 따라야 합니다. 이러한 문제와 한계에 대한 자세한 논의는 Taupin의 작업¹⁴를 검토하는 것이 좋습니다. 면역조직화학 프로토콜의 표준화 과정은 느리고 까다로울 수 있습니다. 이 작업에서는 성공적인 IHC 프로토콜을 관리하기 위한 모든 일반적인 단계를 제시했습니다. 그러나 모든 연구 그룹은 조직, 항체 및 상태를 사전에 테스트하고 평가할 것을 권장합니다. 검사 및 평가는 검사된 각 항체 및 조직에 대해 최소 3가지 수준의 배양, 세척 단계 및 강도로 수행되어야 합니다. 또한 연구원이 특정 요구 사항 및 요구 사항^{20,21,22,23,24,25}를 충족하는 최상의 프로토콜을 선택할 수 있도록 추가 프로토콜을 검토할 것을 권장합니다.

앞서 언급했듯이이 절차에는 과학 기사에서 일반적으로 사용되고 언급되는 몇 가지 단계와 방법 론적 고려 사항이 포함되며 나중에 논의 될 것입니다. 연구자는 기술, 예산, 장비, 설정 및 주요 연구 목표 측면에서 항체를 신중하고 정확하게 선택할 것을 권장합니다. 항체는 나중에 실험에서 테스트 할 동일한 유형의 조직으로 테스트해야합니다. 또한 고정 기술과의 상용성을 테스트하기 위해 동일한 목적(IHC)(즉, 웨스턴 블롯 또는 유세포분석 기술뿐만 아니라)으로 테스트된 항체의 사용을 권장합니다. 복강내 주사, 복강내 주입, 경구 섭취, 또는 뇌실내 주입과 같은 BrdU 염색을 투여하기 위해 상이한 경로가 사용될 수 있다(각 기술에 대한 보다 상세한 설명은 참고문헌²⁶ 참조). 복강 주사를 선택한 경우 BrdU가 장 영역을 피하면서 복강 내로 투여되는지 확인하십시오. 장에는 BrdU가 뇌에 도달하기 전에 고갈될 수 있는 여러 개의 세포가 복제되어 있기 때문에 표지된 세포의 수에 영향을 미칩니다. 얇은 섹션은 용액의 더 나은 침투를 허용하기 때문에 얻는 것이 중요합니다. 40μm 두께의 관상 절편을 연단-꼬리로 절단하고 Kempermann et al.27에 의해 제안된 입체학적 절차에 따라 ²⁴웰 세포 배양 플레이트로 옮겼습니다. 면역 조직 화학은 슬라이드에 장착 된 조직 또는 자유 부동 섹션으로 수행 할 수 있습니다. BrdU는 세포핵 깊숙이 위치하기 때문에 자유 부동 섹션에 용액이 침투하여 더 나은 결과를 제공하고 관심 영역에 더 잘 접근할 수 있습니다. 1차 항-BrdU 항체 접근을 허용하기 위해 DNA 결합(DNA 변성)을 여는 것이 중요합니다. 이 작업에서는 HCI 배양을 사용하여 이러한 특정 절차를 수행했습니다. 한편, 비특이적 에피토프를 차단하는 과정은 세포 신호를보다 정확하게 식별 할 수있게했다.

양호한 막 투과화는 항체가 관심 영역을 적절하게 침투하도록 합니다. Triton X-100과 같은 투과제를 PBS++ 및 PBS+ 용액에 추가하면 막 투과화가 향상됩니다. PBS 및 트리스 완충 식염수(TBS) 시약 모두 이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 예산 측면에서 TBS는 PBS보다 상대성 이론이 저렴할 수 있습니다. 그러나 PBS는 항인산 항체를 방해하고 알칼리성 포스파타제 접합 항체를 억제할 수 있으므로 표적이 인산화에 의해 번역 후 변형(즉, 인산화)되는 경우 PBS의 사용을 피하십시오. 우리는이 작업에 PBS를 사용했으며 조직 세척 단계가보다 구체적인 신호를 제공한다는 것을 알았습니다. 또한 연구자에게 TBS o PBS를 사용하여 최소 3회의 세척 주기를 수행할 것을 권장합니다. 솔루션은 새로 준비해야합니다. 항원 검색(AR)은 3차 및 4차 항원의 구조를 수정하는 고정으로 인한 항원성 손실을 줄이기 위한 방법입니다. 이러한 감소는 항원을 항체^28,29에 의해 검출할 수 없게 만든다. 이 프로토콜에 사용 된 열 유도 에피토프 검색 (HIER)은 고온 또는 강알칼리성 가수 분해 (EDTA pH 8.5 또는 Tris pH 9.5와 같은 다른 완충 용액 사용)에 의해 포름 알데히드와 단백질 사이의 화학 반응을 역전시키려고 시도했습니다. 결과를 비교하고 프로토콜에 가장 적합한 항체를 선택하려면 다양한 AR 프로토콜로 새로운 항체를 테스트하는 것이 중요합니다. 이 마지막 단계는 일반 프로토콜에서 선택 사항일 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜에 대해 더 나은 결과를 제공하기 위해 항원 검색 프로토콜로 조직을 처리했습니다.

비염색 구조를 가시화하고 면역 반응으로 인한 1차 염색 색상을 마스킹하는 것을 방지하는 데 사용되는 기본 염색 색상 및 방법을 고려하여 올바른 최종 대비 색상과 카운터 염색 기술을 선택하는 것이 중요합니다. 형광 현미경의 경우 DAPI (4', 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌)는 DNA의 AT 영역에 결합 할 때 청색 형광 (흡수 : 360 nm, 방출 : 460 nm)을 방출하는 매우 인기있는 핵 및 염색체 대조 염색입니다. DAPI 함유 장착 매체를 사용할 수 있으며 사용하기 쉽습니다. 이는 이미지 획득을 위한 뛰어난 신호 유지를 제공합니다. 과산화물 반응의 경우, IHC는 크레실 바이올렛, 헤마톡실린, 중성 적색 또는 메틸 그린 염색과 같은 상이한 옵션으로 이용가능하였다. 다중 면역염색 기술의 경우, 교차 반응성을 피하기 위해 사용되는 고정 기술과 양립할 수 있는 항체를 선택하는 것이 중요합니다³⁰. 단일 염색의 문제와 합병증이 해결되면 필요에 따라 다른 색상 염색을 투여하십시오. 2차 항체 사이의 비특이적 결합을 조절하는 것이 중요하다. 이는 1차 항체의 동일한 숙주 종에서 생산된 2차 항체를 사용하기 전에 1차 항체를 포화시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 토끼에서 생산된 항 마우스 및 염소에서 생산된 항-토끼 2차 항체를 사용하는 경우, 염소 항체에서 생산된 항-토끼는 토끼에서 생산된 항 마우스 항체를 사용해야 한다. 순차적 방법이 완전히 지배되면 동시 면역 염색 과정을 시작할 수 있습니다. 이 방법에서는 2 차 항체를 적절하게 선택하는 것이 필수적입니다. 이상적으로, 모든 항체는 교차 반응을 피하기 위해 동일한 숙주 동물로부터 나와야 합니다. 염색 방법이 출생 후 해마 조직(이 연령대의 풍부한 신경 발생)에서 정확하게 작동하는지 확인하기 위해 양성 대조군을 실행하는 것이 좋습니다. 양성 대조군 조직에서 염색 문제가 보이면 절차를 검토 및 검토하고 수정 및 조정하고 좋은 염색이 생성 될 때까지 반복하십시오. 그런 다음 음성 대조군을 실행하여 특정 1차 항체를 생략하거나 정상 혈청(1차 항체와 동일한 종)으로 대체하여 항체가 올바르게 작동하는지 테스트합니다. 소개에서 언급했듯이 이미지 디콘볼루션은 강력한 도구이며 컨포칼 현미경을 사용할 수 없을 때 대안을 제공합니다. 투과광 명시야, 광시야 형광 및 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 얻은 모든 이미지에 이미지 디콘볼루션을 적용할 수 있습니다. 이미지 디콘볼루션의 궁극적인 목적은 획득 시스템이 열화된다는 원래 신호를 재구성하는 것입니다¹⁰.

요약하면, 티미 딘 유사체 BrdU의 면역 검출에 의해 시각화 된 새로 생성 된 세포의 식별은 복잡하지만 강력한 기술입니다. 이 연구는 특히 성인 해마 신경 발생 분야의 과학자들이 새로운 세포를보다 정확하게 정량화하는 데 도움을주기위한 시도입니다. 우리는 이러한 노력이 과학계에 도움이 되었고 면역조직화학 기술에 의한 세포 증식 연구를 더 쉽게 미세 조정할 수 있기를 바랍니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT PREPARATION AND SETUP
Donor Horse Serum	BioWest	S0900	Blocking and incubation solutions in PBS
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, flammable
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	746436-500G
Potassium Phosphate, monobasic	J.T Bker	3246-01
Sacarose	J.T Baker	4072-01
Sodium Chloride	Meyer	2365-500G
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Corrisive, to calibrate pH
Sodium Phophate Dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-5KG
Triton-x 100	Sigma-Aldrich	T8787
THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	toxic (mutagenic, teratogenic)
23–27G hypodermic needle	BD PrecisionGlide
Saline solution	PiSA	30130032
Syringes 1 mL	NIPRO
TISSUE PREPARATION
15-ml polypropylene conical tube	Thermo Scientific	339650
50-ml polypropylene conical tube	Thermo Scientific	339652
Dissecting tools
Guillotine	Stoelting
Microtome Cryostat	MICROM	HM525
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts	Corning	3477	pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 12-well carrier kit	Corning	3520	for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 6-well carrier kit	Corning	3521
Perfusion pump	Cole-Parmer	7553-70
Shaker	IKA	ROKCER 3D Digital
IMMUNOSTAINING
Cresyl violet	Sigma-Aldrich	C5042	1%, Light sensitive
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine	Vector Laboratories	SK-4100	carcinogenic, light sensitive
Hydochloric Acid	J.T.Baker	9535-05	Corrosive, to calibrate pH
Hydrogen Peroxide, 50%	Meyer	5375-1L	Toxic, oxidative
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Light sensitive
VECTASTAIN® Elite® ABC Kit Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories	PK-6100	enzymatic, avidin/biotin based amplification system
Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	HPA056030	1:500
Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse	Sigma-Aldrich	B2531	1:250
Secondary antibodies
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-065-151	1:250
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	G-21040	1:1000
Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC	Sigma-Aldrich	T5393	1:250
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC	Invitrogen	F-2765	1:250
Streptavidin, Cy3	Vector Laboratories	SA-1300	1:250
IMAGING AND ANALYSIS
Computer	Dell Computer Company	T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB	For controlling and monitoring protocols’ processes
CCD-camera	Olympus	UC50
CellSens Standard software	Olympus	cellSens Standard Edition	Acquisition Software
Epifluorescent microscope	Olympus	BX53
High-pressure 130 W mercury arc lamp	Olympus	U-HGLGPS
low autofluorescence immersion oil	Olympus	MOIL-30 Type F
Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24  60 mm)
Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76  26 mm)
U-FBW filter cube	Olympus	U-FBW	excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm
U-FGW filter cube	Olympus	U-FGW	excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm
U-FUW filter cube	Olympus	U-FUW	excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm