선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색

요약

여기서 우리는 표준 면역 조직 화학 염색 및 망막 뉴런및 그 하위 세포 구조의 고해상도 화상 진찰의 질을 향상시키기 위하여 전산 망막에 대한 뇌 조직의 CLARITY 방법을 적응하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

원래 Deisseroth 실험실에서 개발한 조직 하이드로겔 탈지법(CLARITY)은 두꺼운 뇌 샘플의 면역 염색 및 이미징에 널리 사용되었습니다. 그러나 이 첨단 기술은 아직 전체 마운트 망막에 사용되지 않았습니다. 망막은 부분적으로 투명하지만, 약 200 μm (마우스)의 두께는 여전히 고해상도 이미징을위한 광 침투를 감소시킬뿐만 아니라 깊은 조직으로 항체의 침투를 제한합니다. 여기서, 우리는 아크릴아미드 단조로 중합하여 나노다공성 하이드로겔을 형성한 다음 단백질 손실을 최소화하고 조직 손상을 피하기 위해 나트륨 도데실 황산염으로 이를 제거함으로써 마우스 망막 전체를 위한 CLARITY 방법을 적용했습니다. CLARITY 처리망막은 망막 뉴런, 글리아 세포 및 시냅스 단백질을 위한 항체로 면역염색되었고, 굴절지수 매칭 용액에 장착되고, 이미지화되었다. 우리의 데이터는 CLARITY가 전체 마운트 준비에서 망막 뉴런 및 신경교 세포를 위한 표준 면역 조직화학 염색 및 화상 진찰의 질을 향상할 수 있다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 도파민성 막막 세포의 미세 축삭 과 수지상 구조의 3D 해상도는 CLARITY에 의해 훨씬 개선되었습니다. 비가공 된 전체 마운트 망막에 비해, CLARITY는 포스트 냅스 밀도 단백질 95와 같은 시냅스 단백질에 대한 면역 스테인링을 나타낼 수 있습니다. 우리의 결과는 CLARITY가 지질제거 후에 망막을 보다 광학적으로 투명하게 만들고 망막 뉴런과 단백질의 미세한 구조를 보존한다는 것을 보여주며, 이는 망막 뉴런과 그 전산 준비에서 그들의 세포 세포 구조의 고해상도 이미징을 얻는 데 일상적으로 사용될 수 있습니다.

서문

척추지통은 아마도 중추 신경계 (CNS)의 가장 접근 할 수있는 부분이며 뇌의 발달, 구조 및 기능을 연구하기위한 훌륭한 모델역할을합니다. 망막에 있는 뉴런의 5개 종류는 2개의 플렉시폼 층에 의해 분리된 3개의 핵 층으로 분포됩니다. 외부 핵층(ONL)은 빛을 전기 신호로 변환하는 고전적인 광수용체(막대 및 원수)로 구성됩니다. 전기 신호는 양극성, 수평 및 막골 세포를 포함하는 내부 핵 층(INL)의 뉴런에 의해 처리된 다음 신경절 세포 층(GCL)에서 망막 신경절 세포(RGC)로 전염된다. RGC는 망막의 출력 뉴런이며, 축축은 이미지 형성 및 비 이미지 형성 시각 기능에 기여하기 위해 뇌에 투사됩니다. 또한, 신경 교 세포의 세 가지 유형 (뮬러 세포, 천체, 마이크로 글리 아) 뉴런에 영양분을 제공 하 고 그들의 세포 외 환경에서 유해한 변화에서 뉴런을 보호.

amacrine 세포의 1개의 특수한 하위 인구는 CNS에 있는 중요한 신경 변조기인 도파민을 생성하고 풀어 놓으며, 빛 적응 도중 망막 신경 회로를^{재구성1,2.} 도파민성 막막 세포(DAC)는 형태학적 프로파일의 독특한 특징을 가지고 있습니다. 그들의 소마타는 내부 플렉시폼 층(IPL)의 가장 단산적인 부분에서 담수체가 마비된 근접 INL에 위치하고 있습니다. DAC의 축슨 과 같은 프로세스는 미근한, 얇고 긴, 희소하게 분기, 곰 정맥류 (도파민 방출의 사이트). 그(것)들은 AII amacrine 세포의 소마타 의 주위에 고리 같이 구조물을 포함하여 IPL에 있는 점선으로 조밀한 신경총을 형성합니다. 축축은 또한 InL을 통해 OPL을 향해 달려가 망막^3을가로질러 원심 통로를 형성합니다. 우리는 DAC 프로세스가 양극성 세포 및 본질적으로 감광성 망막 신경절 세포 (ipRGCs)^4,5,6을포함하여 사전 시냅스 뉴런에서 글루타민산 방출에 대한 응답으로 수용체를 발현한다는 것을^{입증했습니다.} 그러나, 글루타민체 수용체가 축축산, 원원수 또는 둘 다에 발현되는지 여부는 수직 망막 섹션에서 차단되어 서로 구별될 수 없기 때문에^5,6. 면역 염색은 DC의 3차원 분지 및 세포전 구획에 글루타민산 수용체의 존재를 밝히기 위해 전체 마운트 망막에서 수행되어야 합니다. 망막은 상대적으로 투명하지만 마우스 전체 마운트 망막의 두께는 약 200 μm이며, 이는 심부 조직으로 항체의 침투를 제한할 뿐만 아니라 조직 광 산란으로 인한 고해상도 이미징의 광 침투를 감소시킵니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 면역 염색 호환 조직 하이드로겔 탈면 방법 (CLARITY)를 조정하여 최근 두꺼운 뇌 섹션을 위해 전체 마운트 마우스 망막^7에적응시켰다.

CLARITY 방법은 원래 두꺼운 뇌 샘플^7의면역 염색 및 이미징을 위한 Deisseroth 실험실에 의해 개발되었다. 강력한 세제, 도데딜 황산나트륨(SDS) 및 전기포고를 사용하여 지질 성분(조직 광산란을 유발함)을 제거하여 단백질과 핵산을 제자리에 두고 있습니다. 제거된 지질은 아크릴아미드와 같은 하이드로겔 단량체로 구성된 투명한 스캐폴드로 대체되어 남은 단백질 구조를 지원합니다. 지워진 조직은 면역 조직 화학을 통해 표지될 수 있고 조직을 통해 실질적으로 증가한 광 침투 깊이로 심화될 수 있습니다 (조직 표면 아래 최대 몇 밀리미터). 그 이후, CLARITY 방법은 여러 연구 그룹에 의해 최적화되고 단순화되어^8,9,10. 수정된 CLARITY 프로토콜은 수동 클리어링 기술을 사용하여 전뇌 및 기타 온전한^{장기(11)를}지우기 위해 전기전도에 의해 생성된 조직 손상을 방지한다. 그러나 이 방법은 아직 전체 탈산 망막에 적용되지 않았습니다. 여기서, 우리는 면역 히스토케및 이미징을 위해 더 투명하게 하기 위해 전산 망막에 대한 수동 적인 CLARITY 기술을 조정했습니다. 우리는 시험된 망막 단백질의 대다수가 면역 조직화학을 위한 이 프로세스 도중 보존되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 굴절지수 매칭 솔루션을 사용하여 ONL에서 GCL까지 약 200μm 두께의 망막 뉴런을 전신망막에서 이미지화할 수 있었습니다.

프로토콜

마우스 관리 및 모든 실험 절차는 실험실 동물에 대한 건강의 국가 학회 지침에 따라 실시하고 오클랜드 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다 (프로토콜 번호 18071).

참고: 솔루션 이름과 해당 컴포지션의 이름이 표 1에나열됩니다.

1. 조직 준비

1. CO_2의과다 복용으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.
2. 구부러진 집게로 눈을 이결시키고 0.1 M PBS(표 1)와함께 작은 페트리 접시로 옮기습니다. 해부 현미경의 밑에, 바늘로 각막-clera 접합을 따라 작은 구멍을 찌르는. 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 전송합니다.
3. 눈을 PBS로 접시에 다시 옮기. 해부 현미경에서, 각막 -clera 접합주위의 모든 방법을 잘라 해부 가위를 사용합니다. 각막과 렌즈를 제거합니다. 시신경의 기지에서 잘라 조심스럽게 망막을 분리하는 집게로 clera를 벗겨.
4. 망막 주위에 네 개의 작은 컷을 고르게 만들고 PBS에 담근 미세 한 팁 브러시를 사용하여 망막을 안정화시키기 위해 니트로 셀룰로오스 필터 용지에서 작은 사각형 컷에 클로버 모양 (GCL 측면 다운)을 평평하게 놓습니다.
5. (장착 된 망막을 만지지 않고) 니트로 셀룰로오스 종이의 모서리를 잡고 1 시간 동안 4 % PFA와 48 웰 플레이트에 배치하려면 집게를 사용하여 망막을 전송합니다.
6. 필터 용지와 망막을 PBS와 잘 옮기고 씻습니다 (각각 5 분 당 3 배).
7. A4P0(표 1)으로옮기고 부드러운 동요와 함께 4 °C에서 하룻밤 을 배양하십시오.
8. 파이펫 식물성 오일은 A4P0 용액을 완전히 덮습니다. 흔들림 없이 3시간 동안 40°C의 수조에서 배양합니다.
9. PBS에서 세척(각 3배 5분)을 세척하여 모든 오일이 헹구었는지 확인합니다. 필요한 경우 파이프를 사용하여 마지막 헹구기 전에 우물 상단에서 남은 오일을 조심스럽게 제거합니다.
10. 부드러운 흔들림으로 2 일 동안 40 °C에서 10 % SDS로 배양하십시오. 두 번째 날에는 SDS를 신선한 솔루션으로 교체합니다.
11. 트리톤-X-100(PBST, 표 1)을사용하여 필터 용지와 망막을 PBS로 옮기고 세척(각각 1.5시간 동안 5배).
12. PBST에 4°C에 0.01% 나트륨 아지드(NaN_3)로저장하거나 면역염색으로 직접 이동하십시오.

2. 면역 염색 및 굴절률 일치

1. PBST의 미세 한 팁 브러시로 부드럽게 벗겨서 필터 용지에서 망막을 제거하십시오.
2. 1차항체(표 2)에서망막을 배양하여 블로킹 용액(표1)에서2일간 40°C에서 부드러운 흔들림으로 배양한다.
3. PBST에서 세척(각각 5배, 1.5h).
4. 적절한 이차항체(표 3)로배양하여 40°C에서 2일간 블로킹 용액에 희석되어 부드러운 흔들림을 하고 나머지 시술을 통해 빛으로부터 보호한다.
5. 0.02 M 인산염 버퍼(표 1참조)에서 세척(5배, 각 1.5h).
6. 소르비톨 기반 굴절 인덱스 매칭 솔루션(sRIMS, 표 1참조)에서 하룻밤 사이에 40°C에서 부드러운 흔들림으로 배양합니다.

3. 장착

1. 유리 현미경 슬라이드 뒷면의 정사각형 경계를 표시하는 미세 팁 영구 마커가있는 18mm x 18mm x 1.5mm 유리 커버 슬립을 간략하게 설명합니다.
2. 슬라이드를 뒤집어 주사기를 사용하여 슬라이드 앞쪽에 얇은 실리콘 그리스 라인으로 경계를 추적하여 과도한 장착 용액을 피하기 위해 한 모서리에 작은 간격을 남깁니다.
3. 망막을 경계 영역의 중앙으로 옮기고 미세 한 브러시로 배열하여 유리 슬라이드에 대한 광수용체 측면이 평평하도록 하십시오.
4. 파이펫약 60 μL의 sRIMS는 평평한 망막을 덮고 망막이 평평하고 제자리에 머무르는 것을 주의하여 인클로저의 한 구석으로 확장합니다.
5. 스림으로 모퉁이에서 시작하여 커버슬립을 바르고 기포가 형성되지 않도록 사방의 그리스에 닿을 때까지 천천히 낮춥힙슬립을 적용합니다.
6. 장착된 망막의 양쪽에 3개의 커버립을 스페이서로 놓습니다. 다른 슬라이드의 긴 가장자리를 사용하여 마운트가 평평하고 균일하도록 커버 슬립을 누릅니다.
7. 이미징까지 4°C에서 평평하게 슬라이드를 저장합니다.

4. 이미징

1. 기존의 형광 현미경 또는 공초점현미경(재료의 표)에 대한이미지 샘플. 현미경 단계에 슬라이드를 배치하고 샘플을 찾는 것으로 시작합니다.
   참고: 반전된 목표 현미경이 사용되는 경우 슬라이드를 무대에 거꾸로 놓고 먼저 슬라이드의 노출된 영역이 모든 실리콘 그리스 및 장착 용액이 지워지도록 합니다.
2. 공동 표지된 샘플의 z-stacked 이미지를 얻으려면 먼저 각 채널의 신호에 개별적으로 초점을 맞추고 노출 시간 또는 스캔 속도를 각각 설정합니다.
3. 원하는 범위의 위쪽과 하단에 초점 평면을 수동으로 설정하거나 중간점을 설정한 다음 중간점 주변의 범위를 지정하여 z 스택의 범위를 설정합니다.
4. 원하는 대로 단계 크기 또는 슬라이스 수를 조정합니다.
5. 이미지를 캡처하고 원래 파일을 저장하고 TIFF 파일 또는 기타 원하는 형식으로 내보냅니다.

5. 이미지 분석

1. 선택한 이미지 분석 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 단일 이미지와 z스택의3차원 렌더링 모두에서 최적의 선명도가 달성될 때까지 각 채널의 밝기와 콘트라스트를 조정합니다.
   참고: 선택한 단계 크기가 충분히 작으면 신호를 향상시키기 위해 3D 데온볼루션도 수행할 수 있습니다.

결과

수정 된 CLARITY 처리 망막은 광학적으로 투명한 조직입니다.
적절한 탈착을 제공하고 세포 단백질의 구조적 무결성을 유지하면서 망막내의 면역 조직 화학 적 응용 프로그램과 호환되는 조직 청산 방법을 공식화하기 위해, 우리는 전산 마우스 망막에 CLARITY 조직 클리어링 방법을 적용했습니다. 프로토콜을 단순화하고 전체 마운트 망막용으로 수정할 수 있었습니다(프로토콜 참조). ?...

토론

전체 마운트 망막에 대한 CLARITY 프로토콜의 수정.
우리는 대부분의 이전 연구에서 사용되는 것처럼 진공 배출 또는 건조 챔버없이 적절한 중합을 달성하기 위해 CLARITY 프로토콜을^{단순화7,9,11.} 중합 공정은 산소에 의해 억제되며, 프로토콜의 중합 단계 동안 시료를 공기로부터 분리하도록 요구한다. 그러나, 질소?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator