La coltivazione, la crescita e la vitalità dei batteri lattici: una prospettiva di controllo della qualità

Riepilogo

La valutazione del controllo di qualità delle colture di batteri lattici (LAB) è stata confermata come un modo efficace per migliorare la vitalità e la funzionalità dei ceppi LAB per le procedure di fermentazione. Per sostenere questa affermazione, abbiamo sviluppato un protocollo che chiarisce come le colture LAB vengono attivate e coltivate per le procedure di fermentazione e bioprocessing.

Abstract

I batteri lattici (LAB) sono colture starter lattiero-casearie essenziali che sono significativamente impiegate per la produzione di prodotti lattiero-caseari fermentati come yogurt e formaggio. I LAB producono prevalentemente acido lattico come principale prodotto finale della fermentazione e sintetizzano importanti metaboliti che conferiscono le caratteristiche organolettiche dei prodotti alimentari fermentati. I LAB sono batteri fastidiosi che prosperano in molti ambienti quando vengono soddisfatti requisiti nutrizionali adeguati. La richiesta di colture starter LAB superiori per applicazioni di fermentazione nell'industria alimentare e lattiero-casearia ha portato alla necessità di fornire colture vitali e attive per tutte le operazioni di bioprocesso. Lo sviluppo di un protocollo standard per garantire la fattibilità e la maggiore funzionalità delle colture LAB in laboratorio e negli ambienti di lavorazione dei prodotti lattiero-caseari è quindi molto critico. Nell'affrontare le preoccupazioni legate alla rianimazione di cellule di coltura LAB deboli, stressate e ferite, un protocollo che delinea vividamente i passaggi salienti per recuperare, migliorare la rigenerazione cellulare e migliorare la funzionalità metabolica dei ceppi LAB è della massima importanza. Anche il mantenimento della purezza, della funzionalità e della vitalità della coltura per le colture starter LAB è fondamentale. Pertanto, l'aderenza a una linea guida di protocollo unica comporterà la promozione delle prestazioni di fermentazione per molti ceppi LAB dedicati ai processi di fermentazione e biotecnologia. Di conseguenza, il Food Microbiology and Biotechnology Laboratory della North Carolina Agriculture and Technical State University ha sviluppato un protocollo standard per l'attivazione e il controllo di qualità di ceppi LAB selezionati che ha portato a ceppi di coltura LAB altamente funzionali e vitali impiegati per la ricerca sulla fermentazione. L'adattamento e la raccomandazione di un protocollo come questo per l'uso nell'industria lattiero-casearia e alimentare contribuirà a garantire la fattibilità e la funzionalità di LAB per molte applicazioni.

Introduzione

I batteri lattici (LAB) sono un gruppo di batteri unicamente diversi che hanno un potenziale industriale. I ceppi appartenenti a Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus e Streptococcus thermophilus sono per lo più utilizzati come colture starter lattiero-casearie per prodotti lattiero-caseari fermentati come lo yogurt¹. Ceppi LAB selezionati sono anche classificati come probiotici in quanto conferiscono benefici per la salute agli esseri umani quando i dosaggi sono adeguatamente somministrati². I batteri lattici sono anche microrganismi gram-positivi, non sporigeni, non respiranti ma aerotolleranti che sono generalmente caratterizzati dalla produzione di acido lattico come prodotto chiave della fermentazione. LAB sintetizza anche metaboliti essenziali, ad esempio acidi organici, batteriocine e altri composti antimicrobici³ che possono inibire un ampio spettro di agenti patogeni di origine alimentare⁴. L'acido lattico, un importante prodotto finale del catabolismo dei carboidrati e un sottoprodotto della fermentazione LAB, è un metabolita organico che possiede proprietà antimicrobiche ed è potenzialmente utile per applicazioni di bioconservazione degli alimenti ^3,5,6. Inoltre, gli acidi organici prodotti da LAB conferiscono il sapore, la consistenza e l'aroma degli alimenti, migliorando così di conseguenza le loro proprietà organolettiche complessive ^5,6. Le distinte esigenze nutrizionali di LAB insieme alla loro natura onnipresente, consentono ai batteri di prosperare facilmente in ambienti diversi come alimenti a base di latte, alimenti fermentati, verdure e nell'intestino umano⁷.

C'è una crescente domanda di colture starter da parte di LAB per la produzione di yogurt e molte diverse applicazioni lattiero-casearie^8,9, quindi l'attenzione critica e le tecniche scientifiche consolidate dovrebbero essere rispettate, nella coltivazione di ceppi LAB^, così come nell'attivazione di ceppi sia liofilizzati che isolati poiché questa attività è vitale per migliorare le prestazioni di fermentazione. Il laboratorio di Microbiologia e Biotecnologie Alimentari, quindi, si impegna attivamente nello sviluppo di tecnologie adeguate orientate all'attivazione, alla crescita superiore e alle caratteristiche fermentative dei ceppi LAB isolati da prodotti lattiero-caseari fermentati e da colture starter industriali impiegate per la produzione di yogurt. Inoltre, è interessante notare che i ceppi di coltura LAB prodotti industrialmente subiscono attività conservanti come la liofilizzazione e la conservazione congelata, causando stress e lesioni cellulari, a seguito del processo di shock a freddo a cui sono sottoposti¹⁰. Nel limitare le sfide di vitalità e migliorare la funzionalità dei ceppi LAB ottenuti da prodotti alimentari isolati o liofilizzati, è importante attivare correttamente queste colture come forma di controllo di qualità per migliorare le loro caratteristiche fermentative⁸. In questo studio, l'obiettivo era quello di sviluppare un protocollo di controllo della qualità interno per l'attivazione e la crescita di ceppi di coltura di L. delbrueckii subsp. bulgaricus che alla fine ha promosso la crescita vitale di LAB, oltre a migliorare le prestazioni di fermentazione e la funzionalità metabolica dei ceppi LAB. Questo protocollo potrebbe infine essere adattato (utilizzando terreni di coltura ottimali e condizioni di coltura appropriate) per la coltivazione di altri ceppi LAB per la ricerca sulla fermentazione, nonché per scopi industriali o operazioni di bioprocesso. Questo protocollo di attivazione e controllo qualità di LAB garantirà quindi l'ottenimento di colture starter lattiero-casearie vitali superiori e potenzialmente funzionali per diverse applicazioni nell'industria lattiero-casearia e alimentare globale.

Protocollo

1. Materiali e metodi generali

1. Fonte di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
   1. Ottenere ceppi di L. bulgaricus da fonti affidabili.
      NOTA: In questo studio, nello studio di controllo di qualità sono stati utilizzati un totale di cinque (5) ceppi di L. bulgaricus (Tabella 1). Due ceppi di L. bulgaricus liofilizzato per la produzione industriale di prodotti a base di latte fermentato sono stati forniti dal Dr. Albert Krastanov, Dipartimento di Biotecnologie presso l'Università di Tecnologie Alimentari, Plovdiv, Bulgaria. Due ceppi isolati da prodotti commerciali a base di yogurt disponibili sul mercato statunitense sono stati ottenuti dallo stock di -80 °C del laboratorio di microbiologia e biotecnologia alimentare presso la North Carolina A & T State University e un ceppo liofilizzato è stato fornito da un fornitore C. Tutti i ceppi LAB sono stati mantenuti a -80 °C fino a nuovo utilizzo. È stato inoltre valutato un altro ceppo batterico (Limosilactobacillus reuteri) dallo stock di -80 °C del laboratorio di microbiologia e biotecnologia alimentare presso la North Carolina A & T State University.
2. Standard L. MRS fermentatore medio
   1. Preparare deMan, Rogosa Sharpe (MRS) mezzo sciogliendo completamente 55 g di MRS e 0,5 g di L-cisteina in 1 L di acqua deionizzata (DW).
   2. Erogare 7 mL e 2 mL della soluzione MRS preparata in provette, rispettivamente, in autoclave a 121 °C per 15 minuti, quindi raffreddare a temperatura ambiente (RT).
3. MRS agar medium
   1. Preparare l'agar medium MRS sciogliendo completamente 55 g di MRS e 0,5 g di L-cisteina in 1 L di DW. Aggiungere l'agar in polvere (15 g), sterilizzare il mezzo di agar a 121 °C per 15 minuti, quindi raffreddarlo a bagnomaria.
   2. Versare tutti i terreni appena preparati in piastre di Petri sterili e conservarli a 4 °C fino a quando non sarà necessario.
4. Clostridiale medio piruvato rinforzato modificato (mRCM-PYR)
   1. Ottimizzare un mezzo clostridiale rinforzato secondo Oyeniran et al.13 e Nwamaioha e Ibrahim¹⁸, per la selettività e l'accurata enumerazione di L. bulgaricus sciogliendo 10 g di peptone #3, ¹⁰ g di estratto di manzo, 5 g di estratto di lievito, 5 g di cloruro di sodio, 3 g di acetato di sodio, 2 g di fosfato di potassio bibasico_, 0,1 g di uracile, 0,25 g di cloruro di calcio, 5 g di destrosio, 5 g di fruttosio, 10 g di maltosio, 2 g di piruvato di sodio, 0,2% Tween 80 e 0,5 g di L-cisteina in 1 L di DW.
   2. Regolare il pH finale (6,0 ± 0,2) della soluzione utilizzando 6 N HCl prima di aggiungere 0,008% di blu di anilina e 15 g di agar. Autoclavare il mezzo a 121 °C per 15 minuti, raffreddare a bagnomaria e versare in piastre di Petri sterili. Conservare tutti i terreni preparati al momento in piastre di Petri sterili a 4 °C fino al momento del bisogno.
5. Stock di glicerolo di colture LAB
   1. Preparare le scorte di glicerolo (50% glicerolo) diluendo il 100% glicerolo nello stesso volume di DW e sterilizzare a 100 °C per 30 minuti utilizzando un ciclo di sterilizzazione a secco. Raffreddare le scorte di glicerolo in RT e conservarle asetticamente per un ulteriore utilizzo.
   2. Utilizzare la crescita batterica (una singola colonia di L. bulgaricus ottenuta utilizzando il protocollo QC sviluppato) da colture notturne.
   3. Pipettare 500 μL delle colture overnight in glicerolo al 50% in una provetta da centrifuga da 2 mL e mescolarli delicatamente insieme. Congelare e conservare lo stock di glicerolo contenente le colture LAB a una temperatura ultra-bassa di -80 °C fino al momento del bisogno.
      NOTA: Uno schema grafico del protocollo per il controllo qualità e l'attivazione delle colture LAB è mostrato nella Figura 1.

No	Codice Prodotto	Campione	Fonte	Composizione batterica come etichettato1
1	S9	Puro ceppo industriale	Bulgaria	Lb. bulgaricus
2	LB6	Puro ceppo industriale	Bulgaria	Lb. bulgaricus,
3	ATCC 11842	Puro ceppo industriale	ATCC	Lb. bulgaricus
4	TACCOLA	Yogurt	USA	Lb. bulgaricus, altra cultura dal vivo
5	E22	Yogurt	USA	Lb. bulgaricus, altra cultura dal vivo
6	Reuteri	Yogurt	USA	Limosilactobacillus reuteri
1libbra = Lactobacillus

Tabella 1: Ceppi probiotici. La tabella elenca i ceppi probiotici utilizzati in questo studio.

2. Protocollo per l'attivazione e il controllo qualità delle colture LAB

1. Prelevare lo stock di glicerolo preparato di ceppi LAB (in provette da centrifuga da 2 ml) dal congelatore ultra-basso a -80 °C e non lasciarli scongelare prima dell'uso.
2. Pulire e disinfettare l'apertura dei tubi della centrifuga con alcool al 70% e vorticare delicatamente prima dell'uso.
3. Pipettare circa 250 μL (0,25 mL) della coltura LAB madre dalle provette della centrifuga in provette MRS fresche da 2 ml.
4. Vortice delicatamente, parafilmare le provette e incubarle anaerobicamente per una notte a 42 °C per 12-16 ore.
5. Prelevare circa 500 μL (0,5 ml) dalle colture coltivate durante la notte dalle provette MRS da 2 mL in provette MRS fresche da 7 mL, vortice e incubarle anaerobicamente durante la notte a 42 °C per 12-16 ore.
6. Valutare la crescita microbica misurando la densità ottica (OD) o la crescita delle colture a 610 nm con uno spettrofotometro UV-visibile e registrare risultati accettabili tra 0,7 e 0,9.
7. Strisciare le colture notturne dalle provette MRS da 7 mL su piastre di agar MRS e MRCM-PYR e incubarle anaerobicamente per 72 ore a 42 °C.
8. Prelevare le colonie isolate dalle piastre di agar, trasferirle in provette fresche da 7 mL di MRS, vortice delicato e incubarle anaerobicamente durante la notte a 42 °C per 12-16 ore.
9. Conservare le piastre di agar contenenti i ceppi isolati a 4 °C in frigorifero per una settimana.
10. Misurare e confermare l'OD (tra 0,7 e 0,9) dalle provette MRS da 7 mL delle colture LAB isolate dalle piastre striate a 610 nm e utilizzarle come colture di lavoro per tutti gli esperimenti correlati.
11. Eseguire diluizioni dieci volte (diluite in serie) delle colture LAB coltivate dalle provette MRS finali da 7 mL utilizzando 9 ml di acqua peptone (un tampone fisiologico) per ottenere un rapporto 1:10.
12. Infine, prelevare circa 250 μL (0,25 ml) da diluizioni seriali appropriate per tutti gli esperimenti di fermentazione.
13. Attivare il brodo contenente ceppi (250 μL) dal punto 2.12 trasferendoli in brodo MRS fresco da 7 mL e incubandoli anaerobicamente a 42 °C per 16 ore.
14. Continuare ripetendo i passaggi 2.6-2.12 per garantire una crescita cellulare vitale e superiore da colture LAB.
    NOTA: Tutti i ceppi di L. bulgaricus sono stati attivati nel brodo MRS appena preparato e sono stati poi incubati anaerobicamente a 42 °C per 16 ore al fine di raggiungere una densità ottica (OD_{610 nm}) di crescita batterica compresa tra 0,7 e 0,9. La crescita batterica è stata misurata con uno spettrofotometro UV-visibile a 610 nm. I valori di pH delle colture notturne erano compresi tra 3,5 e 5,3 a seguito della produzione di acido lattico, un prodotto finale organico della fermentazione LAB. Sono state rispettate e osservate procedure di sicurezza come la corretta circolazione del flusso d'aria nella cappa di biosicurezza e l'evitare ustioni durante l'uso del bruciatore bunsen.

Figura 1: Uno schema grafico del protocollo per l'attivazione di colture di batteri lattici (LAB). Lo schema fornisce i dettagli e gli strumenti di base necessari per la manipolazione e l'attivazione dei ceppi di coltura LAB. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

La crescita cellulare dei ceppi LAB valutati coltivati con il protocollo di controllo della qualità era significativamente diversa (P < 0,05) rispetto ai ceppi coltivati senza questo protocollo standard. Il protocollo QC sia per L. bulgaricus che per L. reuteri impiegava un approccio multi-subcoltura (subcoltura tre volte prima di striare su piastre di agar), mentre la procedura di controllo prevedeva che la subcoltura fosse eseguita solo una volta con tutte le altre condizioni mantenute costanti. La c...

Discussione

I risultati di tutti i ceppi valutati con il protocollo di controllo qualità e senza l'uso del protocollo erano gli stessi, e come tali sono stati presentati i risultati legati solo ai ceppi (S9 e LB6). I ceppi LAB attivati avevano una crescita cellulare superiore caratterizzata da un'alta intensità di biomassa cellulare, causando quindi un aspetto torbido del brodo fermentativo MRS nella provetta¹¹. La crescita cellulare osservata dopo l'attivazione della coltura è stata evidente tra 12 h e 16...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline Blue	Thermo Scientific	R21526	25 g
Beef extract	Research Products International	50-197-7509	500 g
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Calcium Chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	500 g
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar powder	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrared CO2 Incubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	E22
Limosilactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU)	RD2
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS broth	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Research Products International	50-712-761	500 g
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Sodium pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultra low freezer	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	100 g
UV- visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL