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요약

본 프로토콜은 개선된 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하여 단백질 인산화를 정량화하기 위한 샘플 준비 및 데이터 분석을 기술한다.

초록

인산화는 단백질 기능을 조절하고 세포 신호 전달 결과를 지시하는 필요한 번역 후 변형입니다. 단백질 인산화를 측정하는 현재의 방법은 개별 단백질에 걸친 인산화에서 이질성을 보존할 수 없다. 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석은 유리 커버슬립 상의 단백질의 면역침전을 통해 거대분자 복합체의 조성을 조사하기 위해 개발되었으며, 이어서 단일 분자 이미징이 뒤따랐다. 현재의 기술은 단일 분자 수준에서 전장 막 수용체의 인산화 상태의 강력한 정량화를 제공하는 SiMPull의 적응입니다. 이러한 방식으로 수천 개의 개별 수용체를 이미징하면 단백질 인산화 패턴을 정량화 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 샘플 준비에서 이미징에 이르기까지 최적화된 SiMPull 절차를 자세히 설명합니다. 유리 제제 및 항체 고정 프로토콜의 최적화는 데이터 품질을 더욱 향상시킵니다. 현재 프로토콜은 샘플 내에서 인산화된 수용체의 분획을 계산하는 단일 분자 데이터 분석을 위한 코드를 제공합니다. 이 연구는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 인산화에 초점을 맞추는 반면, 프로토콜은 다른 막 수용체 및 세포질 신호 분자로 일반화 될 수 있습니다.

서문

막-관련 신호전달은 리간드-유도된 막 수용체 활성화 및 신호를 전파하는 하류 부속 단백질의 모집의 조합에 의해 조정된다. 수용체 세포질 꼬리에서 주요 티로신의 인산화는 신호전달 복합체 또는 신호전달복합체 1,2의 형성을 개시하는데 매우 중요하다. 따라서 생물학에서 중요한 질문은 신호 전달 파트너를 모집하고 세포 결과를 지시하기 위해 인산화 패턴을 만들고 유지하는 방법입니다. 이는 시그널 로솜 3,4,5,6,7의 조성을 지시함으로써 신호전달 출력을 조작하는 수단을 제공할 수 있는 풍부하고 특정한 포스포티로신 패턴 모두에서 수용체 인산화의 이질성을 이해하는 것을 포함한다. 그러나, 단백질 인산화를 심문하는 현재의 방법에는 한계가 있다. 웨스턴 블롯 분석은 단백질 인산화의 경향을 설명하는 데 탁월하지만 반 정량적8이며 수천 ~ 수백만 개의 수용체가 함께 평균화되기 때문에 시스템의 이질성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 웨스턴 블롯은 특정 티로신에 대한 포스포 특이적 항체를 사용하여 샘플을 프로빙하는 것을 허용하지만, 동일한 단백질 내의 다중 부위 인산화 패턴에 대한 정보를 제공 할 수는 없습니다. 정량적 인포프로테오믹스는 포스포티로신 풍부도에 대해 보고하지만, 관심있는 잔기가 효소적 소화에 의해 생성되는 동일한 펩티드(전형적으로 7-35개 아미노산) 내에 위치할 필요가 있기 때문에 다중 부위 인산화를 검출하는 데는 한계가 있다 9,10,11.

상기 언급된 한계를 극복하기 위해, 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석은 단일 분자 수준에서 무손상 수용체의 인산화 상태를 정량화하도록 적응되었다. SiMPull은 Jain et al.12,13에 의해 거대 분자 복합체를 심문하기위한 강력한 도구로 처음 입증되었습니다. SiMPull에서, 거대분자 복합체를 항체-기능화된 유리 커버슬립 상에서 면역침전 (IP)시킨 다음, 단백질 서브유닛 수 및 복합 성분12를 갖는 co-IP에 대한 단일 분자 현미경을 통해 분석하였다. SiMBlot이라고 불리는 Kim et al.14의 변형은 변성 단백질의 인산화를 분석하기 위해 SiMPull의 변형을 사용한 최초의 사례였다. SiMBlot 프로토콜은 NeutrAvidin-코팅된 커버슬립을 사용하여 비오티닐화된 세포 표면 단백질을 포획하는 데 의존하며, 이 커버슬립은 포스포 특이적 항체 표지(14)로 인산화를 위해 프로브된다. 이러한 발전에도 불구하고, 번역 후 변형의 정량화를보다 강력하고 광범위한 단백질에 적용 할 수 있도록 개선이 필요했습니다.

본 프로토콜은 다양한 리간드 조건 및 종양원성 돌연변이(15)에 반응하여 무손상 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 인산화 패턴을 정량화하는데 사용된 최적화된 SiMPull 접근법을 기술한다. 이 연구는 EGFR에 초점을 맞추는 반면,이 접근법은 양질의 항체를 사용할 수있는 모든 막 수용체 및 관심있는 세포질 단백질 (POI)에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 샘플 자동 형광을 줄이는 단계, 최대 20개의 샘플을 동시에 준비하여 최소한의 시료 부피를 필요로 하는 샘플 어레이 설계, 항체 표지 및 고정 조건 최적화가 포함됩니다. 데이터 분석 알고리즘은 인산화된 단백질의 단일 분자 검출 및 정량화를 위해 개발되었다.

프로토콜

1. 커버슬립 준비

참고 :이 단계에서는 니트릴 장갑, 안전 안경 또는 안면 보호막의 이중 레이어와 실험실 코트가 포함 된 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다.

  1. 피라냐 에칭을 수행하여 유리에서 유기 파편을 제거하십시오.
    주의: 피라냐 용액은 강한 산화제로서 유기물과 접촉할 때 부식성이 강하고 반응성이 높습니다. 유기 파편과의 반응은 발열성이며 폭발 가능성이 있습니다. 따라서 절차는 새시를 낮추는 화학 흄 후드에서 수행되어야합니다. Pyrex 유리 제품은 피라냐 솔루션을 처리하는 데 필요합니다.
    1. 화학 흄 후드 안에 작업 공간을 준비하십시오. 커버슬립을 4L 유리 비이커인 "반응" 비이커의 바닥에 겹치지 않고 배열하고, 반응 비커를 부드러운 열로 핫플레이트 위에 놓습니다. 유리 제품을 10 분 동안 따뜻하게하십시오. "폐기물" 1 L 유리 비이커를 500 mL의ddH2O근위 반응 비이커에 놓는다.
    2. 49 mL의 12 N 황산 (H2SO4)을 유리 혈청학적 피펫으로 반응 비이커에 천천히 첨가한다. 폐기하기 전에 폐기물 비이커에서 피펫을 헹구십시오.
    3. 21 mL의 30% 과산화수소(H2O2)를 유리 혈청학적 피펫으로 반응 비이커에 적가한다. H2O2액적을 반응 플라스크의 바닥에 고르게 천천히 분산시켜 피라냐 에칭 반응의 국부적인 담금질을 방지한다. 폐기하기 전에 폐기물 비이커에서 피펫을 헹구십시오.
      주의: 항상 H2O2를H2SO4에 첨가하고, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
    4. 피라냐는 커버슬립을 30분 동안 에칭합니다. 5분마다 반응 비커의 내용물을 부드럽게 교반한다.
    5. 폐비이커의 내용물을 반응 비이커에 붓고 피라냐 용액을 켄칭한다. 액체를 반응 비이커의 벽 아래로 천천히 옮겨 튀는 것을 최소화하십시오. 핫플레이트에서 반응 비커를 분리합니다.
    6. 반응물이 급냉되고 냉각될 때, 피라냐 용액을 다시 폐기물 비이커에 부어 중화를 위해 반응 비이커로부터 에칭된 커버슬립을 제거하지 않는다.
    7. 약한 염기의 점진적 첨가로 피라냐 용액을 중화하십시오. 예를 들어, 과도한 질량 20g의 중탄산나트륨(NaHCO3)/100mL 피라냐 용액을 사용한다.
      주의: 피라냐 용액을 밀폐된 폐기물 용기에 보관하지 마십시오. 용액은 폐기 전에 항상 중화되어야합니다. 중화 반응은 격렬한 기포를 생성하고, 약한 염기의 점진적인 첨가에 의해 제어되지 않으면 폭발적일 수 있다.
    8. 중화 된 용액을 유리 교반봉으로 저어주고 2 시간 동안 반응하게하십시오. pH를 >4로 올리고 용액을 폐기하십시오.
    9. 피라냐 용액에 약한 염기를 첨가하는 사이에, 반응 비이커로부터 에칭된 커버슬립을 유리 교반 막대가 있는 부흐너 깔때기로 옮기고ddH2O를 실행하면서 5분 동안 헹구십시오.
      참고: 다음 단계로 즉시 진행하거나 피라냐 에칭된 커버슬립을 ddH2O에 최대2주 동안 밀봉된 유리 용기 또는 페트리 접시에 보관하십시오(밀봉 필름으로 감싸기, 재료 표 참조).
  2. 아래 단계에 따라 커버 슬립을 유기 용제에 넣고 초음파 처리하십시오.
    1. 커버슬립을 유리 코플린 항아리( 표 참조)에 넣고 메탄올(CH3OH)로 덮으십시오. 뚜껑을 씰링 필름으로 항아리에 밀봉하고 10 분 동안 목욕 초음파 처리하십시오. 조심스럽게 메탄올을 코플린 항아리에서 유리 저장 병에 붓습니다.
    2. 코플린 항아리를 아세톤 (C3H6O)으로채우고 뚜껑을 밀봉하고 10 분 동안 목욕 초음파 처리하십시오. 조심스럽게 코플린 항아리에서 아세톤을 유리 저장 병에 붓습니다.
      주의: 메탄올은 가연성이며 매우 독성이 있습니다. 화학 흄 후드에 사용하십시오. 아세톤은 가연성이며 자극제입니다. 따라서 유리에 취급하고 보관하고 화학 흄 후드에 사용하십시오. 현지 규정 및 지침에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오.
      참고: 메탄올과 아세톤은 각각 최대 다섯 번까지 재사용할 수 있습니다.
  3. 실란 기능화를 위해 커버슬립 표면을 활성화합니다.
    1. 20 분 동안 1 M 수산화 칼륨 (KOH)으로 목욕 초음파 처리. 코플린 항아리에서 KOH를 조심스럽게 50mL 원뿔형 튜브에 부어 재사용합니다.
      주의: KOH는 부식성이 있고 자극성이 있습니다. 화학 흄 후드에 사용하고 유리에 보관하지 마십시오. 폴리프로필렌 튜브에 보관하십시오. 현지 규정 및 지침에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오.
      참고: KOH는 최대 다섯 번까지 재사용할 수 있습니다.
    2. 커버슬립에서 ddH2O. 드레인ddH2O로두 번 헹구고 번젠 버너의 화염을 통해 흔들어 각 커버슬립을 가열하여 모든 표면 수분을 제거합니다. 커버 슬립을 마른 코플린 병에 넣으십시오.
  4. 커버슬립 아미노실란화를 수행한다.
    1. 원뿔형 플라스크에서 메탄올 69.4 mL와 아세트산 3.6 mL(CH3COOH)를 혼합하여 아미노실란 용액을 제조하였다. 720μL의 N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(아미노실란)을 첨가하고 잘 섞 는다(물차표 참조).
      주의: 아세트산은 가연성 및 부식성입니다. 유리 피펫으로 취급하고 유리에 보관하십시오. 화학 흄 후드에서 아세트산으로 작업하십시오. 아미노실란은 급성 독성 흡입 위험, 감작제 및 자극제입니다. 그것은 수생 생물에 해롭다. 화학 흄 후드에 사용하십시오. 화학 물질을 현지 규정 및 지침에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오.
      참고: 아미노실란은 감광성이며 물속에서 빠르게 가수분해됩니다. 이 시약을 사용한 모든 단계는 활성을 유지하기 위해 최소한의 조명 조건에서 수행되어야합니다. 병을 질소 가스로 퍼지고 어두운 데시케이터에 보관하기 전에 밀봉 필름을 바르십시오. 6-9 개월마다 교체하십시오.
    2. 아미노실란 용액을 즉시 코플린 항아리에 첨가하십시오. 씰링 필름을 덮고 적용하여 빛으로부터 계속 보호하십시오.
    3. 커버슬립을 아미노실란 용액에서 10분 동안 실온(RT)에서 암흑 속에서 인큐베이션한다. 목욕 - 초음파 처리 1 분 동안 그리고 또 다른 10 분 동안 인큐베이션. 아미노실란 용액을 미량 아미노실란 및 CH3COOH로CH3OH로 지정된 폐기물 용기에 조심스럽게 붓는다.
    4. 커버슬립을 메탄올로 헹구고 용액을 메탄올로 지정된 폐기물 용기에 붓습니다.
    5. 커버슬립을 각각 2분 동안 세 번 헹구고 ddH2 O.커버슬립을 배수하고, 과도한 수분을 닦아내고, 10분 동안 완전히 건조시킵니다.
  5. 커버슬립의 어레이 제제/비오틴-PEG 기능화를 수행한다.
    1. 84.5 mg의 NaHCO3를ddH2O1 mL에 용해시켜 1 M NaHCO3 (pH 8.5) 작업 스톡을 제조하였다. 10 mM NaHCO3의 최종 농도에 대해, 1 M NaHCO3를 ddH2O (1:100)로 희석한다.
    2. 소수성 배리어 펜( 재료 표 참조)으로 건조한 아미노실란화 커버슬립에 그리드 어레이를 그리고 잉크가 건조될 때까지 기다립니다. 커버 슬립에 식별자를 작성하여 적절한 방향을 표시하십시오. 커버 슬립을 가습 챔버에 놓습니다.
      참고: 배열은 16-20개의 사각형, 약 4mm x 4mm 크기로 구성되어야 합니다.
    3. 비오틴-PEG 숙신이미딜 발레레이트(biotin-PEG)/mPEG 숙신이미딜 발레레이트(mPEG) 용액을 만들기 위해, 먼저 냉동실에서 mPEG 및 비오틴-PEG( 물질 표 참조)를 제거하고 RT로 평형화시킨다. 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 mPEG 153mg과 비오틴-PEG 3.9mg(∼1:39 biotin-PEG:mPEG)을 첨가하고, 부드러운 피펫팅을 통해 10mM NaHCO3의 609μL에 재현탁시킨다. RT에서 1분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 기포를 제거하였다.
      참고: pH 8.5 완충액에서 숙신이미딜 발레레이트의 가수분해 반감기는 ~30분이다. mPEG에 완충액을 첨가한 후, 가능한 한 빨리 다음 단계를 진행한다. 이 단계는 매우 중요합니다.
    4. 비오틴-PEG/mPEG 용액을 적용하여 커버슬립 어레이의 각 사각형(일반적으로 제곱당 10-15μL)을 완전히 덮습니다. 액체가 정의된 공간을 넘치지 않도록 하십시오. 커버 슬립을 어둠 속의 습도 챔버에 보관하여 RT에서 3-4 시간 동안 보관하십시오.
    5. 커버슬립을 풍부한 양의 물로 세척하여 ddH2O로 채워진 3x 250 mL 유리 비커에 순차적으로 침지하여 각각 10초 동안세척한다.
    6. 질소 가스로 커버 슬립에서 모든 습기를 제거하십시오. 커버슬립을 -20°C에서 밀봉 필름으로 감싸인 질소가 채워진 50 mL 원뿔형 튜브에 백투백으로 보관한다.
      참고: 즉시 2단계로 진행하거나 커버슬립을 사용하기 전에 최대 1주일 동안 -20°C에서 보관하십시오.

2. SiMPull 용해물의 제조

주의: 프로토콜의 나머지 단계에 필요한 PPE는 니트릴 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트입니다.

주: 용해물을 EGFR-GFP를 발현하는 부착성 CHO 세포로부터 제조하였다. 세포를 60 mm 조직 배양 (TC60) 접시에 밤새12,13 플레이팅하였다. CHO 세포를 10% 소 태아 혈청, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 500 ng/mL의 제네티신으로 보충된 DMEM에서 배양하였다(물질의 표 참조). 다른 부착성 세포주 또는 현탁액 세포가 또한 사용될 수 있다.

  1. 아래 단계에 따라 세포를 플레이트화하십시오.
    1. 배양 접시 (세포 함유)를 1 mL의 1x PBS로 세척한다. 1x 트립신 1 mL를 첨가하고, 세포를 분리하기 위해 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 피펫을 사용하여 분리된 세포를 접시에서 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    2. 10 μL의 트리판 블루를 취하여 별도의 원심분리 튜브에서 10 μL의 세포 현탁액과 혼합한다. 제조업체의 지침에 따라 자동 셀 카운터에서 10μL의 세포 혼합물을 사용하여 세포 계수를 계산 합니다(표 참조).
    3. 플레이트 8 x 105 세포를 TC60 페트리 접시에서 하룻밤 동안 플레이트. 조건 당 한 접시를 접시에 담으십시오.
      참고: 본 연구를 위해, 세포를 처리하지 않거나 단계 2.4.1에 기재된 바와 같이 퍼바나데이트 및 EGF로 처리하였다.
  2. 세포 용해물 준비를 위해 다음 용액을 준비하십시오.
    1. 얼음처럼 차가운 1x PBS (pH 7.4)를 준비하십시오.
    2. 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) 및 프로테아제 / 포스파타제 억제제 (PPI) (재고 1:100)로 보충 된 150 mM NaCl에 1 % 비 이온성, 비 변성 세제 용액 ( 자료 표 참조)의 용해 버퍼를 준비하십시오. 튜브를 너트 레이터에 놓고 버퍼를 15 분 동안 혼합하십시오. 준비된 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
    3. 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mMCaCl2, 10 mM HEPES (pH7.2), 20 mM 글루코스 및 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)의 최종 농도에 대해 티로데스 완충액을 제조하였다 ( 물질의 표 참조). 용액을 37°C로 가온한다.
  3. 1 mM 퍼바나데이트 처리-인산화를 위한 양성 대조군을 준비한다.
    참고: 이 단계는 선택 사항입니다. Pervandate는 바나데이트의 과산화 된 형태입니다 - 단백질 티로신 포스파타제16의 억제제입니다. 포스파타제 활성을 억제함으로써 단백질 탈인산화를 방지하면 고도로 인산화된 샘플이 생성됩니다.
    1. 200 mM 스톡의 활성화된 소르토바나데이트 나트륨 (Na3VO4)을 준비한다.
      1. 100 mL 용액을 제조하기 위해, 3.89 g의Na3VO4(물질 표 참조)를 90 mL의 ddH2O에 첨가하고,교반하면서 용해시킨다. HCl 또는 NaOH를 적가하여 pH를 10으로 조정한다. HCl을 추가하면 용액이 노란색으로 바뀝니다.
      2. ddH2 O.로 부피를 100 mL로가져 와서 전자 레인지에서 가열하여 용액을 끓입니다. 끓인 후, 용액은 무색이 될 것입니다.
      3. 용액을 RT로 냉각하고 pH를 10으로 재조정합니다. pH가 10에서 안정화될 때까지 끓임, 냉각 및 pH 조정을 두 번 내지 네 번 더 반복한다. 분취량을 -20°C에서 보관한다.
    2. 20.4 μL의 3% H2O2와 100 μL의200 mM Na3VO4및546.8 μL의 ddH2O (등몰 농도의H2O2및 활성화된Na3VO4)를 혼합함으로써 30 mM 퍼바나데이트 (PV)의 스톡을 제조하였다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다.
    3. 티로데의 완충액에 1 mM PV를 준비하십시오. 10 mL 용액의 경우, 0.33 mL의 30 mM PV 스톡을 9.67 mL의 37°C 티로데스 완충액에 첨가한다. 세포를 즉시 치료하십시오.
    4. 티로데 버퍼 3mL로 세포를 한 번 씻으십시오. 3 mL의 1 mM PV를 티로데스 완충액에 세포에 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
  4. 리간드 자극을 수행한다.
    1. 적절한 농도, 시간 및 온도를 사용하여 관심있는 리간드로 세포를 자극하십시오. 최대 EGFR 자극을 위해, 37°C에서 5분 동안 티로드 완충액 중의 50 nM 표피 성장 인자 (EGF, 표 참조) + 1 mM의 PV 중 1 mL의 PV와 함께 인큐베이션한다.
  5. 세포 용해를 수행하십시오.
    1. 원하는 세포 처리 후, 접시를 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 1x PBS로 세척한다. 피펫을 사용하여 PBS의 전체 부피를 완전히 제거하였다.
    2. 180 μL의 용해 완충액 (단계 2.2.2)을 플레이트에 첨가한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 주위에 버퍼를 당겨 세포를 완전히 덮으십시오. 배양 표면 전체에 걸쳐 세포 스크래퍼와 견고하고 일관된 압력을 가하여 세포를 완전히 용해시킵니다.
      참고 : 높은 단백질 농도를 보장하기 위해 용해 완충액의 부피를 최소한으로 유지해야합니다.
    3. 용해된 세포를 피펫팅하고 이를 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 튜브를 얼음 위에 30 분 동안 보관하십시오. 소용돌이는 5 분마다 용해됩니다.
      참고: POI가 여러 서브유닛으로 구성되거나 해리에 민감한 경우, 용해물을 와류하지 마십시오.
    4. 용해된 세포를 4°C에서 20분 동안 16,000 x g 에서 원심분리한다. 피펫을 사용하여 상청액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 이것은 총 단백질 용해물을 함유한다.
    5. 용해물 10 μL를 예비하고, 이를 비신코닌성 비색 분석(BCA) 분석을 위해 용해 완충액 90 μL로 희석한다(17). 나머지 총 단백질 용해물을 -80°C에서 보관한다.
    6. BCA 분석을 사용하여 용해물 총 단백질 농도를 확인합니다 ( 물질 표 참조).
      참고: 총 단백질 용해물은 실험 당일에 제조되어 신선하게 사용되거나 최대 12주 동안 -80°C에서 일회용 분취량으로 저장될 수 있다. 동결 / 해동하지 마십시오.

3. 비오티닐화 항체를 사용한 어레이의 기능화

  1. 다음 해결 방법을 준비합니다.
    1. T50 완충액, 10 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 및 50 mM NaCl의 용액. 이 솔루션은 RT에서 1 개월 동안 안정적입니다.
    2. T50-BSA는 T50 버퍼에 0.1 mg/mL의 BSA를 보충합니다. 준비된 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
    3. 10 mg/mL의 소듐 보로하이드라이드 (NaBH4) 1x PBS에서. 사용 직전에 준비하십시오.
    4. 0.2 mg/mL의 NeutrAvidin ( 물질 표 참조)을 T50 완충액에 담았습니다.
      주의:NaBH4 는 환원제이며 가연성입니다. 사용 후 항상 질소 가스로 용기를 정화하고 건조기에 보관하십시오.
  2. 어레이를 비오티닐화 항체로 기능화한다.
    1. PEG-비오틴 기능화된 어레이를 냉동실에서 제거하고 개방 전에 원뿔형 튜브를 RT로 평형화시킨다. 커버슬립을 위로 향하게 한 어레이를 100 mm 조직 배양 (TC100) 디쉬가 늘어선 밀봉 필름 위에 놓습니다.
      참고: 오버헤드 조명을 최소화하십시오. 모든 용액은 소수성 배열에 의해 정의 된 사각형에 "비드 업"해야합니다. 적절한 부피의 용액을 추가하여 각 사각형 (일반적으로 10-15 μL)을 완전히 덮고 액체가 정의 된 공간을 오버플로하지 않도록하십시오. 액체를 신속하게 제거하려면 진공 플라스크에 부착 된 사내 진공 라인을 사용하여 폐기물을 포집하십시오. NaBH4가 화학 흄 후드에서 튜브를 열어 두어 폐기 전에 1 시간 동안 탈기되도록 허용하십시오. NaBH4 처리는 배경 자가형광을 감소시키고, 이로써 위양성 단일 분자 검출을 감소시키기 위해 필요하다.
    2. 어레이의 각 사각형을 RT에서4 분 동안 1x PBS 중의 10 mg/mL의 NaBH4로 처리하십시오. PBS로 세 번 세척하십시오.
    3. T50에서 0.2 mg/mL의 NeutrAvidin과 함께 5분 동안 각 사각형을 인큐베이션한다. T50-BSA로 세 번 씻으십시오.
      참고: NeutrAvidin은 PEG-비오틴에 결합하고 비오티닐화 항체12,13,15에 대한 결합 부위를 제공한다.
    4. T50-BSA 중의 2 μg/mL의 비오티닐화 POI 특이적 항체와 함께 10분 동안 각 사각형을 인큐베이션하고; T50-BSA로 세 번 씻으십시오.
      참고: 본 프로토콜은 EGFR-GFP를 포획하기 위해 비오티닐화 항-EGFR IgG ( 물질의 표 참조)를 사용한다.

4. 전체 세포 용해물로부터의 POI의 SiMPull

참고: 나머지 SiMPull 준비를 위해 기능화된 SiMPull 어레이의 TC100 접시를 얼음 위에 놓습니다. 이 단계는 총 단백질 용해물로부터 POI를 풀다운하는 단계이다. 용해물은 해동 후 재사용해서는 안됩니다.

  1. 다음 해결 방법을 준비합니다.
    1. 1x PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)/0.1% 글루타르알데히드(GA)를 준비합니다.
      주의: PFA와 GA는 독성 화학 정착제와 잠재적 발암 물질입니다. PPE를 착용하십시오. 화학 물질을 현지 규정 및 지침에 따라 유해 폐기물로 폐기하십시오.
    2. 10 mM 트리스-HCl, pH 7.4를 준비한다.
  2. 해동하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 용해물을 혼합하십시오. 얼음 위에 보관하십시오.
  3. 용해물 1μL를 빙냉 T50-BSA/PPI 100μL에 희석합니다.
    참고: 필요한 경우, 어레이에 희석 범위를 적용하여 전체 단백질 용해물의 적절한 희석 계수를 결정하십시오. 어레이 면적 당 SiMPull 수용체의 최적 밀도는 0.04-0.08/μm2이다. 용해물 희석물은 단계 6(데이터 분석)에서 평가될 수 있다.
  4. 용해물을 어레이 상에서 10분 동안 인큐베이션하고; 그런 다음 얼음처럼 차가운 T50-BSA / PPI로 네 번 씻으십시오.
  5. AF647 접합된 항-포스포티로신 항체( 물질 표 참조)를 빙냉 T50-BSA/PPI에 희석하고 어레이 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
    참고: 본 프로토콜에서, 팬 항-pTyr (PY99)-AF647 IgG는 EGFR-GFP의 인산화된 집단을 확인하기 위해 사용된다. 직접 표지된 항체를 사용하면 이차 항체의 필요성이 없어지고 표지 옵션이 증가하고 결과의 일관성이 향상됩니다. 형광-표지된 항체는 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 상업적으로 입수가능하지 않은 경우, 항체는 표준 바이오컨쥬게이션 기술을 사용하여 맞춤 표지될 수 있고, 상업적 바이오컨쥬게이션 키트가 이용가능하다. 형광 표지된 항체의 각 배치는 용량 곡선을 측정하고 포화점을 찾기 위해 SiMPull을 수행하여 최적의 표지 조건을 시험할 필요가 있다.
  6. 얼음처럼 차가운 T50-BSA로 총 6-8 분 동안 6 번 씻으십시오.
  7. 얼음처럼 차가운 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
  8. 항체 해리를 방지하기 위해 어레이를 4% PFA/0.1% GA 용액으로 10분 동안 인큐베이션한다.
  9. 고정제를 불활성화시키기 위해 각각 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS로 5분 동안 두 번 세척한다.
    참고: 하나 이상의 항체를 사용한 실험(예를 들어, 다수의 포스포티로신 부위 검출)의 경우, 단계 4.5-4.9를 반복한다. 두 항체 사이의 입체 장애를 결정하는 방법에 대한 정보는 단계 6.2.9를 참조한다.

5. 이미지 수집

참고: 단일 분자 이미지 수집은 150x TIRF 대물렌즈와 emCCD 카메라의 특정 사분면에 있는 각 스펙트럼 채널을 캡처하는 이미지 스플리터를 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조). 캘리브레이션 이미지는 먼저 3 ~ 1 μm (총 크기 ~ 60 μm ± 60 μm)의 구멍 내 거리에서 20 x 20 어레이 (200 ± 50 nm 구멍으로 구성된 나노 패턴 채널 정렬 그리드 (나노 그리드)× 채널 등록 및 카메라 이득 교정을 허용하기 위해 획득됩니다.

  1. 아래 단계에 따라 채널 등록을 수행합니다.
    참고: 이미터의 공동 현지화를 올바르게 계산하려면 정확한 채널 등록이 필요합니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
    1. 오일 목표를 청소하고 목표에 기름 한 방울을 입금하십시오. 나노 그리드를 이미징 무대에 놓습니다. 전송 된 백색광을 사용하여 그리드 패턴에 중점을 둡니다.
      참고: 나노그리드를 사용한 이미지는 나노그리드를 통과하고 모든 스펙트럼 채널에서 검출되는 투과광을 사용하여 획득됩니다. 대안적으로, 각 채널에서 검출된 형광을 방출하는 다중 형광 비드를 사용할 수 있다. 이미지 수집은 각 현미경 설정에 따라 최적화되어야 합니다.
    2. 그리드의 일련의 20 이미지를 가져옵니다. 픽셀이 포화되지 않았는지 확인하십시오. 이미지 시리즈를 "신탁"으로 저장합니다.
    3. 나노그리드의 초점을 해제하여 통풍이 잘되는 패턴(18)을 생성한다. 게인 보정을 위해 일련의 20개의 이미지를 획득합니다. 이미지를 "게인"으로 저장합니다.
    4. 모든 빛이 카메라로 이동하지 못하도록 차단하여 카메라 오프셋을 위해 일련의 20개의 이미지를 획득합니다. 이미지를 "배경"으로 저장하십시오.
  2. SiMPull 이미지를 가져옵니다.
    참고: 커버슬립 어레이를 이미징하기 전에 Tris 솔루션을 T50-BSA로 교환하고 어레이를 RT로 평형화하십시오.
    1. 오일 목표를 청소하고 목표에 추가 오일을 입금하십시오. 커버슬립 어레이를 현미경 스테이지에 고정합니다.
    2. 각 형광단의 여기 능력, TIRF 각도 및 카메라 통합 시간을 최적화합니다. 목표는 샘플의 광표백을 최소화하면서 가장 높은 신호 대 잡음을 달성하는 것입니다. 향후 측정에서 일관성을 유지하기 위해 레이저 파워를 기록하십시오.
      참고: 본 연구에서는 원거리 적색 채널의 경우 300ms, 녹색 채널의 경우 1ms의 노출 시간을 사용했습니다. 642nm 레이저는 약 500μW 레이저 출력으로 사용되었고, 488nm 레이저는 튜브 렌즈 전에 측정된 860μW에서 사용되었습니다.
    3. 각 샘플에 대한 이미지를 가져옵니다. 원거리 적색 채널을 먼저 이미지화한 다음, 광표백을 줄이기 위해 각각의 더 낮은 파장의 형광단을 이미지화한다. 각 샘플에 사용되는 부피가 적기 때문에 30-45분마다 버퍼 레벨을 확인하고 필요에 따라 보충하십시오.

6. 데이터 분석

  1. 데모 코드를 다운로드합니다.
    참고: 제공된 데모 코드 및 예제 데이터 세트는 전체 데이터 분석 워크플로(보충 코딩 파일 1-4)를 보여줍니다. SiMPullMain.m에 나열된 시스템 요구 사항은 보충 코딩 파일 1에 나와 있습니다.
    1. 압축을 풀 고 개인 문서/MATLAB(MacOS/Linux) 또는 문서\MATLAB(Windows) 디렉토리에 저장합니다 .
      참고: 이렇게 하면 네 개의 새 폴더가 생성됩니다: SiMPull_class, 스마이트, 샘플 데이터, 샘플 분석 출력.
    2. ReadMe_Setup.txt 폴더에 있는 "SiMPull_class" 파일을 엽니다.
    3. MATLAB 및 MATLAB 도구 상자: 곡선 피팅 도구 상자, 병렬 컴퓨팅 도구 상자, 통계 및 기계 학습 도구 상자를 설치합니다.
    4. 다운로드 지침에 따라 DipImage19 를 설치합니다.
    5. ReadMe_setup.txt에 설명된 대로 "스마이트" 단일 분자 분석 패키지를 설치합니다.
      참고: "smite"는 GitHub 리포지토리에서 사용할 수 있습니다(자료 표 참조).
    6. 파일을 MATLAB 창으로 드래그하여 SiMPull_class 폴더에 있는 SiMPullMain.m을 엽니다.
    7. 폴더 찾아보기 아이콘을 클릭하고 폴더를 선택하여 디렉터리를 ...\MATLAB\샘플 데이터\로 변경합니다.
  2. 데이터 처리 단계 개요
    1. SiMPullMain.m을 실행 - 각 섹션에 대한 지침을 따릅니다. 해당 섹션에 커서를 놓고 섹션 실행 아이콘을 클릭하여 각 섹션을 개별적으로 실행합니다.
      참고: 데이터 분석을 위한 일반적인 단계는 이 섹션에 설명되어 있습니다. 자세한 지침은 함께 제공되는 SiMPullMain.m 코드에서 찾을 수 있습니다.
    2. "초기화" 섹션을 실행하여 스펙트럼 채널과 이미지 크기를 정의하는 경로를 설정합니다.
    3. "카메라 게인 및 오프셋 찾기" 섹션을 실행하여 게인 및 배경 데이터 세트를 사용하여 카메라 게인을 광자로 변환합니다.
    4. "채널 등록" 섹션을 실행하여 이미지 등록에 사용되는 로컬 가중 평균 변환을 계산합니다.
    5. 데이터의 서식을 지정하고 큐레이트합니다. "순차적 채널을 쿼드 이미지로 결합" 섹션을 실행합니다. "잘못된 프레임 제거"를 실행하십시오.
    6. "단일 분자를 맞추고 겹치는 분자 찾기"섹션을 실행하십시오.
      참고: 이 섹션에서는 여러 함수를 실행하여 각 채널의 단일 분자를 지역화하고 스펙트럼 채널 간의 공동 지역화 이벤트를 결정합니다.
    7. 실제 GFP 적합당 최소 광자 수를 결정하려면 "최소 광자 임계값 최적화"를 실행하십시오. 이것은 반복적 인 프로세스입니다.
      1. 먼저 smf를 설정합니다. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] 섹션을 실행합니다. 메시지가 표시되면 "빈 데이터" 파일을 선택합니다. "CHO-EGFR-GFP" 파일로 반복합니다.
      2. 두 히스토그램을 비교하여 적절한 최소 임계값을 선택합니다. smf를 설정합니다. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] 섹션을 다시 실행하십시오.
    8. "FR 신호에 대해 GFP 적합 백분율 계산" 섹션을 실행하여 배경 현지화를 수정하고 최종 값을 계산합니다.
    9. 실험적 필요에 따라 옵션 1(6.2.10단계) 또는 옵션 2(6.2.11단계)를 수행합니다.
    10. 옵션 1: 참조15에 기재된 바와 같이 리간드 결합을 위해 원형질막에서 이용가능한 수용체의 수를 정확하다.
      1. 먼저, 표면 수용체를 형광 NHS 에스테르 염료의 포화 수준으로 표지한다(NHS-AF647, 표 참조). 그런 다음 SiMPull 실험을 수행하여 AF647과 공동 지역화하는 GFP 국부화의 비율을 결정합니다.
        참고: 이것은 NHS 표지에 사용할 수 있는 수용체의 분획과 표면 상의 수용체의 비율(SR)의 추정치를 제공한다.
      2. 최종 계산에 SR 보정을 적용합니다: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, NGFP는 GFP 현지화의 보정된 수, NBG는 배경 현지화 번호, NLC는 총 현지화입니다.
        참고: 본 예에서, 이러한 보정은 퍼바나데이트가 막 투과성(16 )이기 때문에 적용되지 않으며, 따라서, 포스파타제 억제의 작용은 표면 수용체에 제한되지 않는다.
    11. 옵션 2: 다중 부위 인산화 측정의 경우, 두 항체를 사용할 때 입체 장애의 가능성을 고려하십시오.
      참고: 입체 장애는 항체 1 단독(P1)에 비해 항체 2(P12)의 존재 하에 있을 때 항체 1에 대한 인산화된 수용체의 관찰된 백분율의 감소를 야기할 수 있다.
      1. SiMPull을 사용하여 P1 및 P12를 결정하고 이전에 발표 된 참조15에 따라 입체 장애에 대한 보정 계수를 계산하십시오.

결과

SiMPull 프로세스를 묘사하는 만화가 그림 1A에 나와 있습니다. 커버슬립은 비오티닐화 항-EGFR 항체의 앵커로서 NeutrAvidin을 사용하여 총 단백질 용해물로부터 EGFR-GFP를 포획하여 기능화된다. 결합되지 않은 단백질을 세척한 후, 인산화된 수용체는 항-포스포티로신(anti-PY) 항체15로 표지된다. 도 1B 는 소수성 어레이의 이미지를 보여주며, ?...

토론

여기에 기술된 프로토콜은 단일 단백질 수준에서 수용체 인산화의 정량적 측정을 가능하게 하도록 최적화되었다. SiMPull 프로토콜에 대한 몇 가지 간단하지만 중요한 변형이 개발되어 NaBH4 처리로 자가 형광을 감소시키고 항체 해리를 방지하기 위해 샘플의 후고정을 포함하여 포스포티 로신 검출을 위한 측정의 신뢰성을 향상시켰다. 녹색 채널 마스크를 사용하여 항-PY 항체와의 공국소화?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 국립 보건원 R35GM126934, R01AI153617 및 R01CA248166에서 DSL로 지원했습니다. EMB는 ASERT-IRACDA 프로그램(NIH K12GM088021)과 UNM MARC 프로그램(NIH 2T34GM008751-20)에 의해 JAR을 통해 지원되었다. 우리는 NIH P30CA118100이 지원하는 뉴 멕시코 대학 종합 암 센터 형광 현미경 공유 자원을 사용하여 감사하게 인정합니다. 우리는 SiMPull의 원래 개발이이 작품에 영감을 준 Ankur Jain 박사와 Taekijip Ha 박사를 인정하고 싶습니다.
ES-C 현재 주소 : 면역 역학 그룹, 통합 암 면역학 실험실, 암 연구 센터, 국립 암 연구소, 베데스다

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaClT50 Buffer
100 mm Tissue Culture dishCELLTREAT229620Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710Hazardous
50 mL conical tubeFunctionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaClLysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dishCorning430166
8% Glutaraldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16020Hazardous
Acetone (C3H6O)Millipore Sigma270725Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay KitPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albuminGold BiotechnologyA-420-1Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer Component
Cell ScraperBioworld30900017-1
Conical Filtering FlaskFisher ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5Electron Microscopy Sciences63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
emCCD cameraAndor iXon
Fetal Bovine Serum, OptimaBio-TechneS12450HHeat Inactivated
Fusion 360 softwareAutodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose)Millipore SigmaD9434Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl)VWRBDH7204-1Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40)Sigma AldrichI8896Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F immersion oilZeiss444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling KitsBiotium92245Suggested conjugation kit
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilaneUCT United ChemicalA0700Hazardous
NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDALook for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 MicroscopeOlympus
Parafilm M Sealing FilmThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Analog Hot PlateCorning6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAbCell Signaling Technology2236BF
Potassium Chloride (KCl)Millipore Sigma529552Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)Millipore Sigma1050330500Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameterRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printerRaise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottlesCorning1395-100CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image SplitterPhotometricsModel QV2
Refrigerated centrifugeEppendorfEP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting SlidesVWR10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis packagehttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma AldrichS6014Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl)Millipore SigmaS9625Activate by successive heat and pH cycling
Sodium HydroxideVWRBDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)Millipore SigmaS6508Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4)Millipore Sigma258105Hazardous
TetraSpeck MicrospheresThermo Fisher ScientificT7279multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) baseMillipore SigmaT1503
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300120

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