Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l'imaging del calcio a due fotoni nel prosencefalo dorsale di zebrafish adulto.

Abstract

Il pesce zebra adulto (Danio rerio) mostra un ricco repertorio di comportamenti per lo studio delle funzioni cognitive. Hanno anche un cervello in miniatura che può essere utilizzato per misurare le attività nelle regioni del cervello attraverso metodi di imaging ottico. Tuttavia, i rapporti sulla registrazione dell'attività cerebrale nel comportamento del pesce zebra adulto sono stati scarsi. Il presente studio descrive le procedure per eseguire l'imaging del calcio a due fotoni nel prosencefalo dorsale di zebrafish adulti. Ci concentriamo sulle misure per impedire al pesce zebra adulto di muovere la testa, il che fornisce stabilità che consente la scansione laser dell'attività cerebrale. Gli animali con la testa trattenuta possono muovere liberamente le parti del corpo e respirare senza aiuti. La procedura mira a ridurre i tempi dell'intervento chirurgico di poggiatesta, ridurre al minimo il movimento cerebrale e massimizzare il numero di neuroni registrati. Qui viene descritta anche una configurazione per presentare un ambiente visivo immersivo durante l'imaging del calcio, che può essere utilizzata per studiare i correlati neurali alla base dei comportamenti attivati visivamente.

Introduzione

L'imaging a fluorescenza del calcio con indicatori geneticamente codificati o coloranti sintetici è stato un potente metodo per misurare l'attività neuronale negli animali comportamentali, inclusi primati non umani, roditori, uccelli e^insetti. L'attività di centinaia di cellule, fino a circa 800 μm sotto la superficie cerebrale, può essere misurata simultaneamente utilizzando l'imaging multi-fotone ^2,3. L'attività di specifici tipi cellulari può anche essere misurata esprimendo indicatori di calcio in popolazioni neuronali geneticamente definite. L'applicazione del metodo di imaging per....

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Academia Sinica. I dettagli degli strumenti di ricerca sono disponibili nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della camera di registrazione

1. Preparare un serbatoio semiesagonale, una piastra di base e uno stadio di testa (Figura 1A; Fascicoli supplementari 1-3). Lo stadio di testa è costituito da due pali metallici fissati a una piastra circolare. La piastra circolare contiene scanal....

Risultati

Il protocollo si compone di due parti: l'intervento chirurgico del poggiatesta e l'imaging a due fotoni delle attività neuronali nel prosencefalo. Il successo dell'intervento chirurgico è definito dalla sopravvivenza dell'animale e dalla stabilità del poggiatesta. Il tasso di sopravvivenza può essere notevolmente migliorato dalla frequente perfusione della soluzione TMS allo 0,01% attraverso la bocca durante l'intervento chirurgico. I pesci dovrebbero riprendersi dall'anestesia e respirare attivamente entro 1-2 minut.......

Discussione

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per trattenere la testa del pesce zebra adulto per l'imaging del calcio a due fotoni. Ci sono due passaggi critici per ottenere un poggiatesta sufficientemente stabile per l'imaging a scansione laser. Innanzitutto, la barra della testa deve essere incollata ai siti di attacco specifici dei teschi. Altre parti del cranio sono spesso troppo sottili per fornire stabilità meccanica e possono anche essere fratturate durante i forti movimenti del corpo. In secondo luogo, la pelle sop.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue